離子交換層析柱和填料 選擇指南

1、離子交換層析柱和填料選擇指南GE醫(yī)療中國GE夢想啟動未來樣品制備為了獲得最佳的分離并避免層析柱性能的退化，正確的樣品制備是必要的。樣本必須是澄清的，無顆粒物質(zhì)。為了去除顆粒物質(zhì)，過濾（過濾器孔徑見緩沖液配制）或離心（10000 g，15分鐘）樣品。脫鹽樣品使用HiTrap? Desalting 5 ml（體積達到1.5 ml）或HiPrep? 26/10 Desalting（體積達到15 ml）轉(zhuǎn)換為所選擇的其實緩沖液。在高鹽濃度下不含

2、主要污染的非常小體積的樣品可以用起始緩沖液稀釋，以降低鹽濃度到不干擾填料的水平結(jié)合。層析柱準備在使用任何IEX填料前洗掉保存溶液和防腐劑。使用預裝層析柱以保證最好的性能分離效果和可重復的結(jié)果所需要的填充床體積是由待純化樣品的量和填料的結(jié)合容量決定。裝柱，層析柱將具有超過所需要結(jié)合容量大約5倍的結(jié)合容量，柱床高度達到20 cm。緩沖液配制有關(guān)揮發(fā)性和非揮發(fā)性緩沖系統(tǒng)的建議見表1。緩沖離子應該具有與IEX填料上功能基團相同的電荷，pKa值在

3、工作pH的0.6 pH內(nèi)。使用的緩沖液濃度足以維持緩沖能力和恒定的pH，一般為20–50 mM。在所有鹽和添加劑被加入后過濾緩沖液，并始終使用高質(zhì)量的水和化學試劑。對于顆粒大小> 90 μm使用1 μm濾膜，對于34 μm顆粒使用0.45 μm濾膜，或者對于顆粒大小< 15 μm，或當需要無菌或需要極其干凈的樣品時使用0.22 μm濾膜。為了避免氣泡產(chǎn)生，確保層析柱和緩沖液在相同溫度下。對于具有未知電荷性質(zhì)的樣品，請嘗試下列

4、條件：- 陰離子交換（Q）起始緩沖液：pH 8.0洗脫緩沖液：含有1 M NaCl的起始緩沖液，pH 8.0- 陽離子交換（S或SP）起始緩沖液：pH 6.0洗脫緩沖液：含有1 M NaCl的起始緩沖液，pH 6.0方法開發(fā)與優(yōu)化（按照優(yōu)先順序）通過測試一系列PH值尋找最佳PH，在這些PH值中感興趣的蛋白質(zhì)是穩(wěn)定的。如果目標蛋白的等電點已知，則以更窄的pH范圍開始，例如可以從離等電點0.5–1 pH單位。如果需要，使用自

5、動化填料搜索程序搜索最佳選擇性（測試強或弱的交換劑）。搜索在選定pH下提供合格分辨率的最陡梯度。搜索保持分辨率和盡可能減少分離時間的最高流速。檢查對于待定填料的推薦流速。搜索可以上樣同時維持滿意的分辨率的最大上樣量。通常，上樣20–30%層析柱總結(jié)合容量提供采用梯度洗脫的最佳分辨率。6.對于大規(guī)模純化，通過轉(zhuǎn)變?yōu)閳D3所示的階段洗脫可以減少分離時間和緩沖液消耗。5–10 CV 5–10 CV] l C a N [層析柱體積（CV）平衡 再

6、平衡樣品 進樣體積不結(jié)合 分子洗脫不要的 物質(zhì)洗脫目標 分子洗脫緊密結(jié)合的 分子洗脫高鹽洗滌01 M圖3.使用階段洗脫的典型IEX分離層析柱清洗樣品和緩沖液的正確制備和每次分離結(jié)束時高鹽洗滌的應用應該能夠保持大多數(shù)層析柱在良好的條件。然而，性能降低、流速變慢、背壓增加或完全堵塞都是填料需要被更嚴格的條件清洗以去除污染物的種種表現(xiàn)。建議在層析柱清洗期間逆向流動，以便使污染物不需要通過整根層析柱。對于每個清洗步驟所需要的柱體積數(shù)和時間根據(jù)污