抗氧化肽的分離及其對(duì)呋喃丹損傷AGS細(xì)胞作用的研究.pdf

1、為了保證提高農(nóng)作物的產(chǎn)量，農(nóng)民在種植農(nóng)作物時(shí)而大量使用氨基甲酸酯類農(nóng)藥除去害蟲與雜草，而該類農(nóng)藥殘留于土壤里面和溶解在水源當(dāng)中，繼而進(jìn)入到了人體內(nèi)，造成人體組織器官的氧化損傷，從而對(duì)組織器官形成致畸性、致癌性。本研究將天然的酪蛋白使用木瓜蛋白酶進(jìn)行水解，酶解后生成水解物（多肽），利用plastein反應(yīng)將生成的水解物進(jìn)行修飾作用，修飾生成新的抗氧化活性肽，plastin修飾產(chǎn)物的抗氧化活性與酪蛋白水解物的相比，前者具有較高的抗氧化活性。

2、將抗氧化活性較高的plastein反應(yīng)產(chǎn)物使用葡聚糖凝膠進(jìn)行分離，收集分離產(chǎn)物，測(cè)定分離得到的不同組分的抗氧化活性。使用酶解多肽產(chǎn)物、抗氧化活性較高的plastein反應(yīng)產(chǎn)物和抗氧化活性較高的分離組分物質(zhì)，將三類產(chǎn)物分別作用于經(jīng)過呋喃丹損傷的AGS細(xì)胞，通過CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率的變化、GSH含量的變化和ROS含量的變化。探究以上三種自制活性肽對(duì)呋喃丹損傷的AGS細(xì)胞的作用。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴將酪蛋白按照特定的條件進(jìn)

3、行酶解反應(yīng)，酶解過程中使用的是木瓜蛋白酶，繼而得到酶水解后的多肽物質(zhì)。通過plastein反應(yīng)修飾，將酶解后的多肽物導(dǎo)入外來(lái)性氨基酸（Phe、Tyr和Try），修飾時(shí)間分別為5h、6h和7h，得到9種不同的修飾產(chǎn)物。得出結(jié)果:類蛋白反應(yīng)時(shí)間為6h時(shí)的plastein產(chǎn)物3的抗氧化活性相對(duì)較高，可以作為下一步分離原料。⑵將plastein修飾產(chǎn)物（6h修飾產(chǎn)物3）通過葡聚糖凝膠進(jìn)行分離。通過不同膠粒、不同流速、不同上樣量探究得到最佳分離柱

4、效圖，即選用葡聚糖凝膠Sephadex G-15，流動(dòng)相過柱的流速為0.5 mL/min，樣品添加量為20 mg/mL時(shí)，得到分離效果最佳。⑶根據(jù)分離效果最好的條件進(jìn)行高純度抗氧化肽的制備。使用蛋白純化儀連用的層析柱制備的抗氧化肽進(jìn)行抗氧化活性分析。經(jīng)過化學(xué)分析方法檢測(cè)得出結(jié)果，峰二(P2)所收集的物質(zhì)的抗氧化活性與plastin反應(yīng)（6h修飾產(chǎn)物3）的抗氧化活性相比較，前者的抗氧化活性有著明顯性的提升(P＜0.05)。繼而，將峰二(P

5、2)產(chǎn)物進(jìn)行純度檢測(cè)。使用HPLC進(jìn)行檢測(cè)，流動(dòng)相分別使用乙腈(TFA)和甲醇(TFA)，結(jié)果都出現(xiàn)單一峰，說(shuō)明抗氧化肽純度較高。⑷使用呋喃丹對(duì)AGS細(xì)胞進(jìn)行損傷處理，建立穩(wěn)定的細(xì)胞損傷模型。使用酪蛋白水解物、6h的plastin反應(yīng)產(chǎn)物3和分離物P2能明顯性的增加細(xì)胞存活率，明顯的降低了ROS生成量在細(xì)胞內(nèi)的生成，并且GSH含量也提高了，說(shuō)明上述物質(zhì)對(duì)細(xì)胞均能起到一定的作用，只是作用程度各不相同。從而證明了不同程度處理方法的抗氧化肽針