海南島橡膠根際嗜鐵細(xì)菌b.subtiliscas15篩選及嗜鐵素基因dhbc克隆、表達(dá)與功能分析

1、山東農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文海南島橡膠根際嗜鐵細(xì)菌B.subtilis CAS15篩選及嗜鐵素基因dhbC克隆、表達(dá)與功能分析姓名：余賢美申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專(zhuān)業(yè)：植物病理學(xué)指導(dǎo)教師：張修國(guó)20090601海南島橡膠根際嗜鐵細(xì)菌B ．s u b t i l i s C A S l 5 篩選及嗜鐵素基因幽6 e 克隆、表達(dá)與功能分析3 ．對(duì)C A S l 5 嗜鐵素分泌影響因素進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，改良M M 培養(yǎng)基為C A S l 5嗜鐵素分

2、泌的最適培養(yǎng)基，以葡萄糖為碳源，以色氨酸為外源氨基酸，p H 7 ．2 ，3 7 。C 條件下培養(yǎng)，有利于C A S l 5 分泌嗜鐵素，可獲得較高產(chǎn)量的嗜鐵素。4 ．通過(guò)室內(nèi)平板對(duì)峙試驗(yàn)研究了C A S l 5 對(duì)1 5 個(gè)常見(jiàn)病原菌的拮抗作用，結(jié)果顯示，C A S l 5 對(duì)這1 5 個(gè)常見(jiàn)病原菌有較強(qiáng)的拮抗作用，拮抗帶寬帶為6 “ “ 1 0m m ；并研究了C A S l 5 菌液過(guò)濾液對(duì)1 5 個(gè)病原菌的抑制作用，結(jié)果顯示，抑

3、制率為2 0 ．1 8 ％' - ' 9 4 ．0 7 ％，表明，C A S l 5 具有較強(qiáng)較廣泛的拮抗譜。5 ．黃瓜種子發(fā)芽試驗(yàn)結(jié)果表明，1 0 0 倍液和1 0 0 0 倍液能有效促進(jìn)芽的生長(zhǎng)，其中1 0 0 倍液效果最好。離體葉片接種試驗(yàn)結(jié)果顯示，C A S l 5 菌懸液對(duì)芒果炭疽病具有較強(qiáng)的抑制作用，病情指數(shù)下降了5 3 ．3 4 ％，防效達(dá)到7 8 ．9 5 ％，表明C A S l 5 具有較好的促進(jìn)植物生

4、長(zhǎng)及生物防治潛能。6 ．根據(jù)已報(bào)道的枯草芽孢桿菌基因組序列，設(shè)計(jì)特異性引物，通過(guò)P C R 擴(kuò)增，獲得了C A S l 5 d h b C 基因片段，該片段長(zhǎng)1 1 9 7b p ，預(yù)期編碼3 9 8 個(gè)氨基酸殘基的多肽。B L A S T n 搜索結(jié)果顯示，該基因片段與B ．s u b t i l i ss u b s p ．s u b t i l i ss t r ．1 6 8 和B a c i l l u ss u b t i l

5、 i ss u b s p ．s u b t i l i s s t r ．N C I B 3 6 1 0 的d h b C 基因序列( a c c e s s i o n N o ．Z 9 9 1 2 0 ．2 和N ZA B Q L 0 1 0 0 0 0 0 5 ．1 ) 分別具有9 9 ．7 4 ％和9 9 ．5 8 ％同源性，在核苷酸序列上，分別只有4 個(gè)和5 個(gè)堿基不同，在氨基酸序列上，分別有2 個(gè)和3 個(gè)氨基酸殘基不同。7

6、 ．通過(guò)網(wǎng)絡(luò)工具h(yuǎn) t t p ：／／w w w ．e x p a s y ．o r g ／對(duì)C A S l 5d h b C 基因編碼產(chǎn)物D h b C 進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析與預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示：C A S l 5 d h b C 基因編碼產(chǎn)物的等電點(diǎn)為5 ．3 0 ，為酸性蛋白質(zhì)，穩(wěn)定系數(shù)為5 3 ．0 0 ，表明該蛋白質(zhì)性質(zhì)不穩(wěn)定；總平均疏水指數(shù)( G r a n da v e r a g e o fh y d r o p a t h i c

7、 i t y , G R A V Y ) 為．0 ．3 0 3 ；D h b C 蛋白含有帶負(fù)電荷的氨基酸殘基( A s p + G l u )5 7 個(gè)，帶正電荷的氨基酸殘基( 心+ L y s ) 3 9 個(gè)，總原子數(shù)為6 0 9 8 ，其分子式為c 。9 ，o H 3 0 3 9 1 ' , 1 5 。5 0 5 9 2 S 。2 ；D h b C 蛋白含有5 個(gè)蛋白激酶C 一磷酸化位點(diǎn)；含有6 個(gè)酪蛋白激酶I I 磷酸化

8、位點(diǎn)，1 個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)及2 個(gè)N ．豆蔻酰化位點(diǎn)；由于其蛋白結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性，D h b C 有可能由氨基酸1 4 ．3 9 4 ，1 2 2 ．3 9 7 ，6 9 ．3 9 3 各形成一種三級(jí)結(jié)構(gòu)模型。8 ．將C A S l 5 d h b C 基因片段連接到表達(dá)載體p E T - 3 0 a ( + ) ，并經(jīng)氯化鈣轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入大腸桿菌B L 2 1 ( D E 3 ) ，獲得工程菌E ．c o l iB L 2 1 ( D