多環(huán)芳烴菲降解細(xì)菌的分離、鑒定和鄰苯二酚-2，3-雙加氧酶基因的克隆.pdf

1、多環(huán)芳烴(PAHs)是一類廣泛分布于海洋環(huán)境中的含有兩個(gè)以上苯環(huán)的有機(jī)化學(xué)污染物，因其具有潛在的致癌、致畸和致突變毒性作用，引起學(xué)者的廣泛關(guān)注。微生物修復(fù)是消除PAHs污染的經(jīng)濟(jì)高效的方式。研究降解菌的遺傳控制、探索代謝途徑、解析相關(guān)酶系和功能基因，從而構(gòu)建基因工程菌株用于污染環(huán)境的生物修復(fù)是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。 本研究采集自廈門(mén)博坦油碼頭的海水樣品，以具有代表性的PAHs——菲為降解底物，考察在連續(xù)的轉(zhuǎn)接馴化過(guò)程中，降解菲的混合菌

2、系的群落結(jié)構(gòu)的變化。以平板升華的方法篩選對(duì)菲具有明顯降解效果的菌株，再通過(guò)高效液相色譜(HPLC)證實(shí)降解菌的降解能力。之后構(gòu)建降解菌的基因文庫(kù)，篩選參與菲降解的關(guān)鍵酶基因。 主要得到以下幾個(gè)結(jié)果： 1.用變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析了以菲為底物的混合菌系的群落變化過(guò)程，并對(duì)其中的兩條清晰條帶進(jìn)行割膠回收，測(cè)序，其中序列4與鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)同源性99％，序列5與伯克霍爾德菌(Burkhold

3、eria)同源性100％。 2.用平板升華的方法篩選獲得一株產(chǎn)生明顯降解圈的菌株，定名為H。經(jīng)16SrDNA分子鑒定，降解菌H歸于鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)。高效液相色譜(HPLC)結(jié)果表明，降解菌H在5天之內(nèi)降解了81.9％終濃度為400mgL-1的菲，24h內(nèi)最大降解速率達(dá)到5.95mgL-1h-1，添加酵母粉沒(méi)有促進(jìn)降解菌對(duì)菲的利用。降解菌H的最適生長(zhǎng)溫度為30℃，最適pH為8.0。比較混合菌系和降解菌的D

4、GGE圖譜，降解菌H在混合菌系中占有重要的地位，與條帶2對(duì)應(yīng)。在菲誘導(dǎo)下，降解菌H的全細(xì)胞蛋白的表達(dá)發(fā)生了變化，說(shuō)明在降解菌H中，參與菲降解的基因是可誘導(dǎo)的。噴灑鄰苯二酚，降解菌H能夠迅速產(chǎn)生黃色的2-羥粘糠酸半醛(2-HMS)。 3.提取降解菌H總DNA，sau3AI不完全酶切，以pUC19為載體，E.coliDH5α為宿主，構(gòu)建3-10Kb的基因文庫(kù)。以鄰苯二酚為底物篩選，獲得了帶有鄰苯二酚2，3-雙加氧酶(C23DO)基因

5、的陽(yáng)性克隆子。經(jīng)過(guò)測(cè)序和核酸序列的分析，目的片段依次是C23DO基因、功能未知的基因和HMSD基因的片段，屬于S-type間位裂解操縱子。通過(guò)氨基酸序列的推導(dǎo)和比對(duì)，降解菌H的C23DO基因和HMSD基因與Novosphingobiumaromaticivorans的相應(yīng)序列同源性最高；系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果顯示，它們與鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)的序列歸于一群，而與其他菌屬的序列差異較大。用鄰苯二酚誘導(dǎo)陽(yáng)性克隆子，產(chǎn)生了明顯的差異