多環(huán)芳烴、多氯聯(lián)苯優(yōu)良降解菌的分離鑒定及降解特性研究.pdf

1、作為持久性有機(jī)污染物（Persistent organic pollutants，POPs）的典型代表，多環(huán)芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）和多氯聯(lián)苯（polychlorinated biphenyls，PCBs）的分析方法、環(huán)境影響及其污染修復(fù)技術(shù)是目前國(guó)內(nèi)外熱點(diǎn)研究領(lǐng)域，生物降解特別是微生物降解被認(rèn)為是去除環(huán)境中PAHs、PCBs的主要途徑。本文在全面綜述國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究的基礎(chǔ)上，通過(guò)

2、調(diào)查和監(jiān)測(cè)選擇并確定了PAHs、PCBs污染的土壤樣品，篩選得到的一株可以高效降解PAHs、PCBs的菌株，基于形態(tài)學(xué)特征、生理生化試驗(yàn)、細(xì)胞化學(xué)成分鑒定及16S rDNA序列比對(duì)分析等手段，鑒定該菌株屬于兩面神菌屬（Janibacter sp.），命名為JY11。以此為基礎(chǔ)，系統(tǒng)研究了JY11對(duì)PAHs、PCBs的降解效果和影響因素以及與Phanerochaete. chrysosporium JY16聯(lián)合降解效率，并借助氣相色譜--

3、質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)降解中間產(chǎn)物的定性分析，初步探討了該菌株對(duì)菲、芘、苯并（α）芘和PCB18、PCB77的代謝途徑。論文主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下： 1.污染土壤中PAHs和變壓器油中PCBs的提取及分析 （1）采用索氏提取、超聲提取及超臨界CO2提取三種樣品前處理技術(shù)，結(jié)合GC-FID分析技術(shù)，研究獲得了濟(jì)南煉油廠及勝利油田土壤中PAHs的污染特征。濟(jì)南煉油廠土壤中檢出全部16種PAHs，濃度范圍為5.0～593.2μg/kg

4、；勝利油田采油廠土壤中檢出12種PAHs，濃度范圍為227.7～1107.3μg/kg，兩處土壤均在一定程度上受到了PAHs的污染。三種提取技術(shù)均有很好的提取效率和重現(xiàn)性，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD％）小于5％（n=3），PAHs加標(biāo)回收率為88.7％～102.6％，符合美國(guó)EPA標(biāo)準(zhǔn)中環(huán)境樣品回收率（70％-140％）及RSD％（<20％）的要求。 （2）采用液液萃取、超聲萃取及固相萃取等三種樣品前處理技術(shù)，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室前期建立的PC

5、Bs分析方法，研究建立了簡(jiǎn)便快速的PCBs提取及GC-ECD分析技術(shù)。研究測(cè)定了廢棄國(guó)產(chǎn)變壓器油中類二噁英類及阻轉(zhuǎn)類PCBs的成分與含量，檢出10種類二噁英類PCBs（PCB77，81，105，114，118，123，126，156，167，189）和4種阻轉(zhuǎn)類PCBs（PCB45，95，132，149）。實(shí)驗(yàn)還結(jié)合Arcolor1242標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)變壓器油中PCBs組分進(jìn)行了分析，得到PCBs的分布特征：二氯聯(lián)苯含量為14.2％；三氯聯(lián)苯

6、含量為51.2％；四氯聯(lián)苯含量為29.8％；五氯和六氯聯(lián)苯含量為4.8％。由此可見(jiàn)，國(guó)產(chǎn)變壓器油以三氯聯(lián)苯為主，高氯代PCBs所占比例很少。三種提取方法的RSD％均小于5％（n=3），內(nèi)標(biāo)PCB209的回收率為82.3％～91.6％，符合美國(guó)EPA標(biāo)準(zhǔn)中回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差的要求。 2.PAHs、PCBs降解菌的分離與鑒定 （1） PAHs、PCBs優(yōu)勢(shì)降解菌的分離。采集濟(jì)南市煉油廠、勝利油田采油廠及原濟(jì)南市變壓器廠的土樣

7、，以菲、蒽、芘的混合樣品為唯一碳源，采用定時(shí)定量轉(zhuǎn)接、逐步提高碳源濃度的方法，共獲得125個(gè)單菌落，經(jīng)降解效率初步測(cè)定，選取降解能力較強(qiáng)的兩株細(xì)菌JY11和JY3A進(jìn)行鑒定研究。 （2） JY11和JY3A的鑒定。通過(guò)形態(tài)特征描述，綜合運(yùn)用生理生化檢測(cè)、脂肪酸分析、甲基萘醌分型及GC摩爾百分含量測(cè)定等方法，結(jié)合16S rDNA序列分析、構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，JY3A被認(rèn)為屬于Bacillus菌屬的B.subtilis類群，由于Bacil

8、lus菌屬目前定名的復(fù)雜性和不確定性，尚需進(jìn)一步PFGE和DNA-DNA雜交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持鑒定到種。 （3） JY11被鑒定為Janibacter菌屬。該屬1997年方予以命名，確定模式種為Janibacter limosus，至今僅有5個(gè)種的報(bào)道。但JY11與該屬模式種有較大差異，與其遺傳距離最近的為Janibacter anophelis。細(xì)胞脂肪酸組成及含量分析結(jié)果表明，JY11在脂肪酸化學(xué)分類特征上表現(xiàn)出獨(dú)特的菌株特異性，不

9、同于Janibacter limosus和Janibacter anophelis的已有報(bào)道。初步實(shí)驗(yàn)表明JY11在表現(xiàn)出良好的PAHs降解能力的同時(shí)，對(duì)PCBs亦有較好的降解能力，因此選擇JY11菌作為后續(xù)研究的出發(fā)菌株。 3.Janibacter sp. JY11對(duì)PAHs、PCBs的降解效果及影響因素研究 （1） Janibacter sp. JY11對(duì)PAHs的降解效果 研究了液體培養(yǎng)條件下，Janib

10、acter sp. JY11對(duì)初始濃度為100 mgl PAHs的降解效果。結(jié)果表明，Janibacter sp. JY11不僅對(duì)低分子量PAHs如菲、芴、苊等有很好的降解效果，對(duì)四環(huán)的芘、熒蒽、苯并（α）蒽等也有較好的降解效果，五環(huán)和六環(huán)的高分子量PAHs也有不同程度的降解。由此可見(jiàn)，JY11表現(xiàn)出非常寬的降解底物譜及很強(qiáng)的降解能力。 （2）影響Janibacter sp. JYI1對(duì)PAHs的降解效率的因素 實(shí)驗(yàn)中分

11、別以三環(huán)的菲、四環(huán)的芘和五環(huán)的苯并（α）芘為代表，研究了不同PAHs初始濃度、不同濃度的表面活性劑Tween80和Triton X-100及水楊酸誘導(dǎo)作用對(duì)PAHs降解效率的影響。結(jié)果表明：隨著初始濃度的增加，芘和苯并（α）芘的降解效率逐漸降低，而菲則可以在很寬的濃度范圍內(nèi)全部降解；表面活性劑Tween80對(duì)PAHs降解有一定的促進(jìn)作用；通過(guò)用水楊酸做共代謝底物，相比用菲作共代謝底物，苯并（α）芘的降解效率提高了28％。 （3）

12、Janibacter sp. JY11對(duì)PCBs的降解效果 實(shí)驗(yàn)研究了在液相純培養(yǎng)條件下，JY11對(duì)初始濃度分別10 mg/l及100 mg/lPCBs的降解效果。結(jié)果表明，隨著初始濃度增加，降解效率略有下降，但總體上JY11對(duì)PCBs具有較好的降解效果。對(duì)于初始濃度為10 mg/l的PCBs，二氯及三氯PCBs的降解效率為83％～100％，多數(shù)高于90％；四氯PCBs的降解效率為78％～94％；五氯及六氯PCBs的降解效率也

13、達(dá)到50～65％。JY11對(duì)鄰位、對(duì)位取代PCBs均可降解，只是隨著氯原子數(shù)增加，降解效率降低。由此可見(jiàn)，氯原子取代位置并不是影響JY11對(duì)PCBs降解的主要因素。 （4）天然植物組分誘導(dǎo)Janibacter sp. JY11降解PCBs 通過(guò)在液體培養(yǎng)基中添加九州蟲草子座揮發(fā)油、唐古特青蘭揮發(fā)油、草果揮發(fā)油、香芹酮、檸檬烯等天然植物組分，考察了其對(duì)Jannibactor sp. JY11降解PCBs效率的影響。結(jié)果表明

14、九州蟲草子座揮發(fā)油、香芹酮能顯著提高絕大多數(shù)PCBs的降解效率，檸檬稀也有一定的促進(jìn)作用。 4. Janibacter sp. JY11-P. chrysosporium JY16聯(lián)合降解PAHs、PCBs利用白腐真菌胞外氧化還原酶系豐富，底物專一性低，對(duì)外源物質(zhì)的降解不受其濃度大小的影響等優(yōu)點(diǎn)，在Janibacter sp. JY11中加入一株白腐真菌-黃孢原毛平革菌（P.chrysosporium JY16），研究其聯(lián)合降解

15、作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：液體培養(yǎng)條件下，混合菌對(duì)PAHs的降解效果明顯好于單一菌降解效果，尤其是四環(huán)的芘和五環(huán)的苯并（α）葸、苯并（k）熒蒽的降解效率相比JY11單獨(dú)降解提高了20％以上。 5. Janibacter sp. JY11降解PAHs、PCBs中間產(chǎn)物及代謝途徑初步分析 以三環(huán)的菲、四環(huán)的芘和五環(huán)的苯并（a）芘作為JY11降解PAHs代謝途徑分析的研究對(duì)象；以三氯PCB18及類二噁英類PCB77作為JY11降解

16、PCBs代謝途徑分析的研究對(duì)象，利用GC-MS技術(shù)，通過(guò)對(duì)中間產(chǎn)物的檢測(cè)，初步推導(dǎo)了JY11降解PAHs、PCBs的代謝途徑。 （1）菲：菲在雙加氧酶的作用下生成順式-2，3-二氫-二羥基菲，然后轉(zhuǎn)化成1-羥基-二萘酸，脫羧后生成1-萘酚，最后開(kāi)環(huán)生成水楊酸。 （2）芘：芘在雙加氧酶的作用下生成順式-4，5-二氫-二羥基芘，然后在脫氫酶作用下重新芳香化生成順式-4，5-二羥基芘，該產(chǎn)物進(jìn)一步通過(guò)雙加氧酶開(kāi)環(huán)生成4，5-二羧酸

17、菲，最終在脫羧酶的作用下生成4-羥基菲，最后開(kāi)環(huán)生成鄰苯二甲酸。 （3）苯并（α）芘：苯并（α）芘在雙加氧酶的作用下生成順式-7，8-二氫-二羥基苯并（α）芘，然后在脫氫酶作用下重新芳香化生成順式7，8-二羥基苯并（α）芘，該產(chǎn)物進(jìn)一步通過(guò)雙加氧酶開(kāi)環(huán)生成7-羥基-8-羧酸芘。 （4）三氯聯(lián)苯PCB18和四氯聯(lián)苯PCB77代謝途徑基本相同，即JY11進(jìn)攻PCBs的2，3位，生成2，3-二氫二羥基-PCBs，該產(chǎn)物在脫氫酶的作