參附注射液對lps刺激的tetonhmgb1過表達(dá)raw264.7細(xì)胞hmgb1表達(dá)的影響

1、1 l i [ L [ 1 l l l l l lJ l l [ 1 [ 1 l l l l l l l l l l l l [ [ [ 1 1 1 1 1 1 1 1 , L [ [ 1 l lY 3 2 3 2 6 3 2分類號 R 2 8 5 5U D C 6 1 0 密級學(xué)校代號 】Q 盟2學(xué) 號 2 0 1 4 1 1 0 4 3 7 4廣州中醫(yī)藥大學(xué)G u a n g z h o uU n i v e r s i t y o

2、 fC h i n e s eM e d i c i n e碩士學(xué)位論文參附注射液對L P S 刺激的T e t —o n —H M G B I 過表達(dá)R A W 2 6 4 ．7 細(xì)胞H M G B l 表達(dá)的影響學(xué)位申請人指導(dǎo)教師姓名專 業(yè) 名 稱申請學(xué)位類型論文提交日期黃慧娜黎暉研究員中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)科學(xué)學(xué)位2 0 I 7 年3 月摘要研究目的：膿毒血癥臨床發(fā)病率和死亡率高居不下，預(yù)后不良，是急危重癥醫(yī)學(xué)面臨的一大難題。膿毒血癥嚴(yán)重

3、影響生存質(zhì)量，也帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。高遷移率族蛋白B 1( H M G B l ) 在內(nèi)毒素休克晚期可以分泌出胞，加劇炎癥級聯(lián)瀑布反應(yīng)，具有致死性毒性。因此，控制H M G B l 的釋放可能是控制炎癥擴(kuò)大的關(guān)鍵，H M G B l 可作為防治膿毒血癥的一個(gè)重要靶標(biāo)。參附湯組方實(shí)源自《傷寒論》四逆加人參湯，是扶陽固脫的典型代表方劑，臨床上參附注射液( S F ) 廣泛應(yīng)用于治療陽氣暴脫“厥脫證”( 休克) ，目前關(guān)于其對H M G B

4、 l表達(dá)的影響及機(jī)制探討的報(bào)道較少。本研究將通過脂多糖( L P S ) 誘導(dǎo)T e t —o n —H M G B l基因過表達(dá)的小鼠單核一巨噬細(xì)胞株R A W 2 6 4 ．7 建立炎癥細(xì)胞模型，研究S F 對L P S 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞H M G B l 表達(dá)的影響，以期探索參附液注射液治療膿毒血癥的分子機(jī)制及中醫(yī)扶正祛邪理論。研究方法與內(nèi)容：1 ．以2 9 3 T 細(xì)胞為研究對象，將實(shí)驗(yàn)分為正常組、L P S 組、正丁酸鈉( S

5、B ) 組、S F ( 8 u L ／m L 、1 2p L ／m L 、1 4u L ／m L ) 組共六組，將H M G B l 啟動子質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)入細(xì)胞構(gòu)建細(xì)胞H M G B l 基因啟動子驅(qū)動的熒光素酶( L u c ) 報(bào)告基因系統(tǒng)，正常組不做任何處理，L P S 組用O ．2 u g ／m LL P S 處理，藥物組先使用0 ．2 u g ／m L L P S 預(yù)刺激O ．5 h 后，再按分組給藥2 4 h 。采用報(bào)告基因檢測，

6、分析S F 對H M G B l 啟動子活性的影響。2 ．以T e t —o n —H M G B l 基因過表達(dá)R A W 2 6 4 ．7 細(xì)胞株為研究對象，正常組、L P S 組、正丁酸鈉( S B ) 組、S F ( 8 u L ／m L 、1 2u L ／m L 、1 4 u L ／m L ) 組共六組，以上各組給藥前加入四環(huán)素( T e t ) 啟動外源性H M G B l 基因表達(dá)，隨后正常組不做任何處理，L P S組用0

7、 ．2u g ／m L L P S 處理，藥物組先使用0 ．2 u g ／m L L P S 預(yù)刺激0 ．5 h 后，再按分組給藥2 4 h 。2 ．1 ．按照以上分組，各組分組給藥后2 4 h ，提取m R N A ，采用q R T —P C R 法進(jìn)行檢測，分析S F 對H M G B lm R N A 表達(dá)的影響。2 ．2 ．按照以上分組，各組分組給藥后2 4 h ，提取各組培養(yǎng)細(xì)胞總蛋白，采用w e s t e r n —b l

8、 o t 檢測H M G B l 表達(dá)情況。用H M G B l 抗體可以標(biāo)記H M G B l 蛋白、用f l a g 抗體可以區(qū)別標(biāo)記外源性H M G B l 一f l a g 蛋白。2 ．3 ．按照以上分組，各組分組給藥后2 4 h ，收集細(xì)胞上清液，用小鼠H M G B lE L I S Ak i t 操作方法檢測H M G B l 在細(xì)胞上清的分泌表達(dá)量。2 ．4 ．按照以上分組，細(xì)胞培養(yǎng)在載玻片上，各組分組給藥后2 4 h