huh7.5.1細(xì)胞感染hcv并干擾素治療過(guò)程中mirna表達(dá)譜的變化的研究

1、浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文Huh7.5.1細(xì)胞感染HCV并干擾素治療過(guò)程中miRNA表達(dá)譜的變化的研究姓名：魯袞申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專(zhuān)業(yè)：藥理學(xué)指導(dǎo)教師：陳智2012-11-30浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文 中文摘要錄水平上的基因沉默( t r a n —s c r i p t i o n a lg e n es i l e n c i n g ，T G S ) ，另一種是轉(zhuǎn)錄后基因沉默( p o s t - t r a n s c r i p t i

2、 o n a l g e n e s i l e n - c i n g ，P T G S ) ，即在基因轉(zhuǎn)錄后的水平上通過(guò)對(duì)目標(biāo)R N A 進(jìn)行特異性降解而導(dǎo)致基因失活。這是為了保護(hù)自身，動(dòng)植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中形成的一種限制外源核酸入侵的防衛(wèi)保護(hù)機(jī)制。M i c r o R N A ( M i R N A ) 是細(xì)胞內(nèi)一類(lèi)表達(dá)豐富、非編碼的高度保守的小R N A ，長(zhǎng)度為1 8 ．2 5n t 。M i R N A 表現(xiàn)出一種轉(zhuǎn)錄后調(diào)

3、控基因表達(dá)的全新機(jī)制，它通過(guò)結(jié)合靶基因的m R N A 的3 ’U T R 抑制基因的表達(dá)。M i R N A 已經(jīng)被證實(shí)在發(fā)育、感染、免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)和腫瘤的發(fā)生等多種生理與病理過(guò)程中發(fā)揮作用。從最初發(fā)現(xiàn)到現(xiàn)在，已經(jīng)在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了7 0 0 多個(gè)M i R N A ，其中絕大部分M i R N A 的生物學(xué)功能是未知的。已有報(bào)道，M i R N A 參與免疫應(yīng)答中多方面的調(diào)控作用。但目前為止，尚未見(jiàn)報(bào)道M i R N A 能夠調(diào)

4、控干擾素的信號(hào)通路進(jìn)而影響抗病毒天然免疫，也沒(méi)有報(bào)道M i R N A 參與到干擾素對(duì)免疫細(xì)胞功能的調(diào)控作用。正是基于上述研究背景，我們?yōu)榱颂綄た赡軐?duì)丙型肝炎病毒( H C V ) 轉(zhuǎn)染，復(fù)制及清除有作用的M i R N A ，我們首先通過(guò)對(duì)p F L ．J 6 J F H ．1 質(zhì)粒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄得到H C VR N A 的轉(zhuǎn)錄體，然后在H u h 7 ．5 ．1 細(xì)胞培養(yǎng)達(dá)到6 0 ％～7 0 ％匯合度時(shí)，把H C V R N A 轉(zhuǎn)

5、染進(jìn)去。轉(zhuǎn)染后第3 天，提取感染細(xì)胞內(nèi)的總R N A ，并通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，與正常H u h 7 ．5 ．1 細(xì)胞作對(duì)比，以確定轉(zhuǎn)染是否成功。然后用I F N O L ．2 B 處理上述感染細(xì)胞，4 8 h 后再次使用熒光定量P C R 對(duì)細(xì)胞內(nèi)R N A 進(jìn)行檢測(cè)，并與未經(jīng)任何處理的感染細(xì)胞作對(duì)比。最后采用M i R N A 表達(dá)譜芯片技術(shù)對(duì)正常H u h 7 ．5 ．1 細(xì)胞，H C V 感染后的H u h 7 ．5 ．

6、1 細(xì)胞，以及感染后經(jīng)干擾素治療的H u h 7 ．5 ．1 細(xì)胞分別進(jìn)行了M i R N A 的表達(dá)的測(cè)定，并采用2 ( ．A A C T ) 法分析組間M i R N A 的表達(dá)情況。結(jié)果經(jīng)過(guò)篩選我們發(fā)現(xiàn)與正常H u h 7 ．5 ．1 細(xì)胞中表達(dá)的M i R N A 相比，有1 3 種M i R N A 在H C V 感染后表達(dá)上調(diào)，而在干擾素治療后則出現(xiàn)下調(diào)；另外還有7 種M i R N A 則在H C V 感染后出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)，