第二章 抗原與抗體

1、第二部分 B細(xì)胞和T細(xì)胞應(yīng)答的產(chǎn)生,B細(xì)胞和T細(xì)胞應(yīng)答的產(chǎn)生,抗原和抗體補(bǔ)體系統(tǒng)主要組織相容性復(fù)合物和抗原遞呈T細(xì)胞B細(xì)胞,第二章 抗原和抗體,抗原和抗體,抗原的基本知識(shí)抗體的基本知識(shí)免疫球蛋白基因的組成與表達(dá)抗原抗體相互作用,第一節(jié) 抗原的基本知識(shí),,抗原性與免疫原性,,免疫原性(immunogenicity),誘導(dǎo)體液和/或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的能力?？乖?antigenicity),與免疫反

2、應(yīng)最終產(chǎn)物(如抗體和/或T細(xì)胞表面受體)特異結(jié)合的能力。有免疫原性也有抗原性，但是反之并非這樣。,抗原與半抗原,免疫原(immunogen), 具有免疫原性半抗原(hapten), 僅具有抗原性抗原/免疫原(antigen /immunogen,在同一動(dòng)物機(jī)體內(nèi)是同意詞)，能夠誘導(dǎo)機(jī)體免疫反應(yīng)并與相應(yīng)抗體或T細(xì)胞受體發(fā)生特異反應(yīng)的物質(zhì)。一個(gè)物質(zhì)能否作為抗原，既取決于機(jī)體，也取決于抗原本身,免疫系統(tǒng)的抗原結(jié)合分子,抗體

3、 (免疫球蛋白，Ig)T細(xì)胞受體(TCR)主要組織相容性復(fù)合體(MHC),,導(dǎo)致免疫原性的抗原特性,外源性分子大小 MW.>5000-10000化學(xué)組成與復(fù)雜性 如異聚物比同聚物免疫原性更強(qiáng)抗原加工和遞呈的敏感性 如不可溶的大分子通常是比可溶性小分子免疫原性更強(qiáng)（不可溶的大分子易于吞噬和加工）；不能被降解遞呈的大分子物質(zhì)免疫原性很低。,,外源性(Foreignness),機(jī)體對(duì)“我/非我”

4、 (self/nonself)的識(shí)別導(dǎo)致免疫反應(yīng) 我? 耐受 (在淋巴細(xì)胞發(fā)育期間未成熟淋巴細(xì)胞與自身成分相接觸) 非我? 反應(yīng) (抗原在這一關(guān)鍵時(shí)期沒有與未成熟淋巴細(xì)胞相接觸)免疫原與被免疫動(dòng)物之間在系統(tǒng)發(fā)育上距離的遠(yuǎn)近，免疫原保守性的強(qiáng)弱，影響免疫原性的強(qiáng)弱。,,導(dǎo)致免疫原性的生物系統(tǒng),宿主的遺傳組成 MHC，BCR和TCR等基因嚴(yán)重影響免疫原性抗原的免疫方式 免疫劑量、免疫途徑與免疫次數(shù)

5、佐劑的使用,,佐劑(Adjuvants),定義：當(dāng)與抗原混合一起注射能增強(qiáng)抗原免疫原性的物質(zhì)。佐劑增強(qiáng)免疫原性的主要表現(xiàn)方式： 1）延長抗原的存在 2）增強(qiáng)輔刺激信號(hào) 3）局部炎性增強(qiáng)(肉芽腫，granuloma，或其它炎性細(xì)胞反應(yīng)) 4）使被刺激的淋巴細(xì)胞非特異性增殖費(fèi)氏佐劑(Freund’s adjuvants) 1)不完全佐劑(IFA): 石蠟油、羊毛脂等，可減少抗原用量到1%，

6、延長抗體合成期 2)完全佐劑(CFA): 在IFA中加入結(jié)核菌或該菌細(xì)胞壁，其作用在于增強(qiáng)宿主細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答及抗體合成,,常用佐劑基本作用方式,,抗原表位(Epitopes),免疫細(xì)胞不識(shí)別或作用于完整的抗原分子，替代的淋巴細(xì)胞僅識(shí)別大分子中個(gè)別的位點(diǎn)，這些位點(diǎn)稱為抗原表位(Epitopes)或抗原決定簇(Antigen determinants)淋巴細(xì)胞與復(fù)雜抗原的相互作用，可能發(fā)生在抗原結(jié)構(gòu)的幾個(gè)不同水平上。

7、B、T淋巴細(xì)胞識(shí)別不同的抗原表位。,T細(xì)胞與B細(xì)胞抗原識(shí)別的比較,,B細(xì)胞抗原表位的特性,天然蛋白的B細(xì)胞抗原表位通常由蛋白表面的親水氨基酸組成，易于接近膜結(jié)合或自由的抗體。順序抗原表位(Sequential Epitopes),連續(xù)抗原表位(Continuous Epitopes),蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)抗原表位(Continuous Epitopes),不連續(xù)抗原表位(Discontinuous Epitopes)，蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu),

8、,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與抗原表位,一級(jí)結(jié)構(gòu)與順序表位二級(jí)結(jié)構(gòu)與抗原反應(yīng)性三級(jí)結(jié)構(gòu)與結(jié)構(gòu)表位四級(jí)結(jié)構(gòu)與結(jié)構(gòu)表位、免疫原價(jià)數(shù),,半抗原的免疫特性,,半抗原僅具有抗原性（反應(yīng)原性，特異性）當(dāng)與某種載體偶聯(lián)后（半抗原載體結(jié)合物，hapten-carrier conjugate）能表現(xiàn)免疫原性半抗原載體結(jié)合物的特異性存在三類抗原決定 1）半抗原決定簇 2）未受影響的載體蛋白表位 3）半抗原和載體分子結(jié)合區(qū)形成的新表位,第二

9、節(jié) 抗體的基本知識(shí),,抗體(Antibody),,抗體，是與特定抗原發(fā)生特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)(免疫球蛋白,Ig)B細(xì)胞表面抗體識(shí)別免疫原，啟動(dòng)記憶B細(xì)胞和漿細(xì)胞的增殖和分化漿細(xì)胞分泌具有抗原特異性的可溶性抗體分子可溶性抗體分子與親本B細(xì)胞表面受體具有相同的抗原識(shí)別性,抗體的基本結(jié)構(gòu)與功能,,共同的4肽鏈結(jié)構(gòu)：兩條相同的輕鏈(L, ~22,000 Da), 兩條相同的重鏈(H, ~55,000 Da)每條輕鏈和重鏈間通過二硫

10、鍵和非共價(jià)鍵連接成異二聚體(H-L)，兩個(gè)相同的H-L再結(jié)合成(H-L)2的抗體基本結(jié)構(gòu)不同抗體間，輕鏈和重鏈最初的約110aa是改變很大的，稱為可變(Variable, V)區(qū)；其余部分則相當(dāng)保守，稱為固定(Constant, C)區(qū)。重鏈上連有糖鏈。抗體的基本結(jié)構(gòu)是與其功能（抗原結(jié)合；效應(yīng)功能介導(dǎo)）相對(duì)應(yīng)的,免疫球蛋白基本結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn),,1940年前后，Tiselius & Kabat 發(fā)現(xiàn)抗體的活性存在于血清γ-球蛋白

11、R. Porter，木瓜蛋白酶(papain)消化γ-球蛋白中的IgGA. Nisonoff，胃蛋白酶(pepsin)消化IgGG.Edelman, 2-巰基乙醇（mercaptoethanol）還原Fab (fragment, antigen-binding);Fc (fragment, crystallizable),150，000Da,50，000Da,45，000Da,100，000Da,50，000Da,22，000

12、Da,多發(fā)性骨髓瘤與抗體氨基酸序列的研究,,一個(gè)問題：γ-球蛋白中的抗體群是有許多不同抗體組成的，而aa序列分析需要純蛋白正常個(gè)體的漿細(xì)胞，末期細(xì)胞，僅在有限的時(shí)間分泌抗體。多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma）病人的骨髓瘤細(xì)胞（腫瘤漿細(xì)胞）能無限增殖，持續(xù)分泌特異性抗體。患者血清中95%的免疫球蛋白是這種骨髓瘤蛋白，其中許多病人的骨髓瘤細(xì)胞分泌超量的輕鏈蛋白。Bence-Jones首先在尿液中發(fā)現(xiàn)了這些超量的輕鏈蛋白，稱

13、為Bence-Jones蛋白。,Normal plasma cells help protect the body from germs and other harmful substances.,Myeloma cell (abnormal plasma cell) making M proteins.,輕鏈、重鏈分型與抗體分類,,根據(jù)C區(qū)aa順序（一級(jí)結(jié)構(gòu)）輕鏈：κ (kappa) 和λ (lambda)重鏈：μ (mu)、γ(

14、gamma)、α(alpha)、δ(delta)、ε(epsilon)依據(jù)重鏈分型不同Ig分為IgM、IgG、IgA、IgD和IgE5類,免疫球蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)：反平行β片層和環(huán)狀結(jié)構(gòu)(loops),,免疫球蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu),,免疫球蛋白的四級(jí)結(jié)構(gòu),,可變區(qū)與抗原結(jié)合,,不同特異性抗體可變區(qū)的氨基酸順序比較顯示，變異僅集中在其中一些獨(dú)特的區(qū)域（占總氨基酸的15-20%），這些區(qū)域被稱為超變區(qū)（hypervariable regions）;

15、其余區(qū)域稱為框架區(qū)（framework regions）超變區(qū)是抗原結(jié)合位，與抗原表位互補(bǔ)，又稱為互補(bǔ)決定區(qū)（complement-determining regions， CDRs）。CDRs位于環(huán)狀結(jié)構(gòu)。,固定區(qū)與抗體生物活性,CL和CH1：有助于提高抗原結(jié)合，升高Fab臂最大旋轉(zhuǎn)性，參與抗體多樣性鉸鏈區(qū)（IgA、IgD、IgG）,富含Pro和Cys，富有彈性，形成二硫鍵IgE、IgM的CH2區(qū)功能不確定IgA、IgD、I

16、gG的CH2或IgE、IgM的CH3連接有糖基，因而親水性較強(qiáng)， IgM、IgG通過此結(jié)構(gòu)域激活補(bǔ)體，發(fā)生生物學(xué)效應(yīng)?？贵wFc片段上兩結(jié)構(gòu)域共同與細(xì)胞膜Fc受體結(jié)合，發(fā)揮不同的生物學(xué)效應(yīng)。,分泌免疫球蛋白(sIg)與膜結(jié)合免疫球蛋白(mIg),,Secreted immunoglobulin（sIg）Membrane-bound immunoglobulin（mIg）sIg的重鏈羧末端結(jié)構(gòu)域（IgA、IgD、IgG的CH3或IgE

17、、IgM的CH4）在結(jié)構(gòu)和功能上不同于mIg的相應(yīng)結(jié)構(gòu)域 sIg:親水型aa組成 mIg包括三段不同序列： 胞外親水序列 疏水跨膜序列（26aa） 胞質(zhì)部分,B細(xì)胞不同發(fā)育階段表達(dá)不同類型的Ig,,B細(xì)胞不同發(fā)育階段表達(dá)不同類型的Ig,但表達(dá)不同類型Ig的同一細(xì)胞，其抗原特異性一致。,免疫球蛋白種類與功能多樣性,,免疫球蛋白的抗原決定,

18、,同種型（Isotype） 由C區(qū)決定同種異型（Allotype） 由C區(qū)同一基因位置上不同等位基因的差異決定獨(dú)特型（Idiotype） 由可變區(qū)決定,Fc受體識(shí)別抗體Fc區(qū),,抗體—B細(xì)胞Fc受體—B細(xì)胞、T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞,免疫球蛋白超家族,,單克隆抗體,,多克隆抗體： 抗原多個(gè)表位誘導(dǎo)多種B細(xì)胞克隆增生與分化，產(chǎn)生多種抗體的混合物

19、單克隆抗體：單個(gè)抗原表位誘導(dǎo)單種B細(xì)胞克隆增生與分化，產(chǎn)生單克隆抗體,單克隆抗體與細(xì)胞分化簇(CD),細(xì)胞分化簇(clusters of differentiation, CD)：白細(xì)胞表面的免疫功能分子，通過獨(dú)特的單克隆抗體的識(shí)別，能夠區(qū)分不同世系和階段的免疫細(xì)胞CD1-CD350,第三節(jié) 免疫球蛋白基因的組成與表達(dá),基因表達(dá)的中心法則,,B細(xì)胞發(fā)育與免疫球蛋白基因表達(dá),,抗體的特征與其基因表達(dá),,與抗體特異性相應(yīng)的巨大的抗體多樣

20、性Ig中存在著重鏈和輕鏈氨基端的可變區(qū)與羧基端的固定區(qū)具有相同抗原特異性的同型抗體，是具有既定的可變區(qū)和不同的重鏈固定區(qū),抗體多樣性的產(chǎn)生可變區(qū)基因的重排固定區(qū)基因的種類替換Ig基因的表達(dá)、合成、裝配和分泌,解釋抗體結(jié)構(gòu)多樣性的遺傳理論,,胚系理論（ germ-line theories ），認(rèn)為胚胎細(xì)胞（卵和精子）基因組含有大量的Ig基因，不存在導(dǎo)致抗體多樣性的特殊遺傳理論。無法解釋： 當(dāng)固定區(qū)不變時(shí)，產(chǎn)生可變區(qū)多樣性的進(jìn)

21、化機(jī)制體細(xì)胞變異理論（somatic-variation theories）， 基因組包含有相對(duì)小數(shù)目的Ig基因，大量的抗體特異性產(chǎn)生于體細(xì)胞的變異或重組。無法解釋： 當(dāng)產(chǎn)生可變區(qū)多樣性時(shí)，保證固定區(qū)不變的機(jī)制,Dreyer & Bennett的雙基因模式(Two-Gene Model，1965年),,兩個(gè)分開的基因編碼一條Ig的重鏈或輕鏈，一個(gè)基因編碼可變區(qū)，另一個(gè)編碼固定區(qū)； 這兩個(gè)基因在DNA水平同步以保證轉(zhuǎn)錄和

22、翻譯為一條單獨(dú)的重鏈或輕鏈； 在胚系中，存在著成百上千的可變區(qū)基因，而僅需要存在一個(gè)單獨(dú)的固定區(qū)基因。 問題：當(dāng)時(shí)沒有直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，而且與“一個(gè)基因編碼一條多肽鏈”的生物學(xué)原則矛盾。,利根川進(jìn)(Susnmu Tonegawa)理論：免疫球蛋白基因重排,,1976年提出，1987年獲諾獎(jiǎng) V區(qū)和C區(qū)基因呈分離狀態(tài)，并在B細(xì)胞分化成熟過程中不斷進(jìn)行重排,,目前的理論：免疫球蛋白基因的多基因組成,,κ和λ輕鏈以及重鏈由位于不同染色

23、體上分開的多基因家族編碼。 在胚系DNA中，每個(gè)多基因家族包含多個(gè)被非編碼區(qū)分割的編碼序列，稱為基因片段（gene segments)。,重鏈,λ輕鏈,κ輕鏈,,小鼠免疫球蛋白胚系基因片段的組成,,基因可變區(qū)重排：輕鏈DNA的V-J重排,,基因可變區(qū)重排：重鏈DNA的V-J重排,,基因可變區(qū)重排的機(jī)制：重組信號(hào)序列引導(dǎo)重組,重組信號(hào)序列(recombin-ation signal sequences, RSS):位于基因片段側(cè)翼(V

24、的3’；J的5’；D的兩側(cè))的小段DNA序列。 功能:作為重排基因的重組加工信號(hào)。 RSS組成:保守的回文結(jié)構(gòu)七聚體+12或23bp的間隔序列+保守的富含AT的九聚體 One-turn RSS:含12bp間隔序列的; Two-turn RSS: 含23bp間隔的序列。 它們總是相互連接，因此稱為one-turn/two-turn連接規(guī)則或12/23規(guī)則。,基因可變區(qū)重排的機(jī)制：重組酶連接基因片段,V(D)J重組酶:催化RSSs與

25、編碼序列間的連接反應(yīng)(V-(D)-J重組)。RAG (recombination- activating genes)-1和RAG-2，僅在淋巴細(xì)胞特異表達(dá)。 刪除連接與翻轉(zhuǎn)連接 具體的一些步驟：1) 重組酶識(shí)別RSSs，兩信號(hào)序列和鄰近的編碼序列靠近到一起 2) RAG-1和RAG-2在信號(hào)序列和編碼序列結(jié)合處單鏈切割 3) RAG-1和RAG-2催化DNA的雙鏈切割，同時(shí)在編碼序列末端和信號(hào)序列雙鏈切割的末端產(chǎn)生一個(gè)發(fā)夾

26、結(jié)構(gòu),基因可變區(qū)重排的機(jī)制：重組酶連接基因片段,4）單鏈內(nèi)切核酸酶隨機(jī)切割發(fā)夾結(jié)構(gòu)產(chǎn)生回文的P-區(qū)核苷酸加入；5）末端脫氧核酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)在重鏈 V,D,J編碼序列的切割末端加上至15個(gè)核苷酸的N-區(qū)核苷酸；雙鏈斷裂修補(bǔ)酶（DSBR）修補(bǔ)和連接組合編碼序列和信號(hào)序列，產(chǎn)生編碼連接序列和信號(hào)連接序列,基因可變區(qū)重排的機(jī)制：連接彈性(連接多樣性),連接彈性（junctional flexibility）, 又稱連接多樣性（junct

27、ional diversity），即在V-(D)-J重排中，信號(hào)序列與編碼序列的鏈接是精確的，而隨后的編碼序列間的連接是不精確的。 連接彈性的結(jié)果導(dǎo)致了重排的多樣性，也導(dǎo)致某些重排是沒有結(jié)果的。,基因可變區(qū)重排的機(jī)制：等位基因排斥確保了單抗原特異性,等位基因排斥（allelic exclusion），在一個(gè)B細(xì)胞中，雖然B細(xì)胞是二倍體，但是僅表達(dá)來自一條染色體的重鏈重排基因或輕鏈重排基因。確保了功能B細(xì)胞從不表達(dá)多于一個(gè)的VHDHJ

28、H或VLJL 這一現(xiàn)象提示一旦一個(gè)VHDHJH或VLJL重排物產(chǎn)生，重組的機(jī)制就關(guān)閉了,等位基因排斥的模型，首先重鏈基因重排，一旦一個(gè)重鏈基因重排發(fā)生，其蛋白產(chǎn)物就阻止別的重鏈等位基因重排事件, 而啟動(dòng)輕鏈基因重排。,抗體多樣性的產(chǎn)生,多胚系基因片段：Multiple germ-line gene segments V-(D)-J連接組合：Combinatorial V-(D)-J joining 連接彈性： Junctiona

29、l flexibility P-區(qū)核苷酸增加：P-region nucleotide addition (P-addition) N-區(qū)核苷酸增加：N-region nucleotide addition (N-addition) 體細(xì)胞高突變： Somatic hypermutation 輕重鏈組合： Combinatorial association of light and heavy chains,多胚系基因片段與V-(

30、D)-J連接組合,連接彈性:信號(hào)序列精確連接，編碼序列連接不精確,P核苷酸增加和N-核苷酸增加中的隨機(jī)性,B細(xì)胞發(fā)生隨機(jī)的高頻率體細(xì)胞突變,固定區(qū)基因間的種類轉(zhuǎn)換(class switching),種類轉(zhuǎn)換: B細(xì)胞抗原刺激后，重鏈DNA進(jìn)行進(jìn)一步的重排，VHDHJH 能與任何CH基因片段結(jié)合。這一過程稱為種類轉(zhuǎn)換或同型轉(zhuǎn)換，其參與的DNA側(cè)翼序列(轉(zhuǎn)換區(qū) ，switch regions) 位于每個(gè)CH片段的上游。 轉(zhuǎn)換信號(hào)來自于細(xì)胞

31、因子。,IL-4誘導(dǎo)的種類轉(zhuǎn)換機(jī)制,Ig基因表達(dá) （mIg or sIg）,Ig基因表達(dá)(同時(shí)表達(dá)IgM和IgD）,免疫球蛋白的合成、裝配和分泌,免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,第四節(jié) 抗原-抗體相互作用,主要內(nèi)容,抗原抗體反應(yīng)的原理交叉反應(yīng) (Cross Reactivity)沉淀反應(yīng)和凝集反應(yīng)抗原抗體反應(yīng)的應(yīng)用 放免測定、Elisa、Western Blot·····

32、;·,抗原抗體反應(yīng)的原理,抗原抗體之間的相互作用力： 氫鍵 離子鍵 疏水作用力 范德華力,親和力可以用來衡量抗原抗體的結(jié)合能力,抗原抗體反應(yīng)的化學(xué)平衡,平衡常數(shù),平衡常數(shù)又稱為親和力常數(shù)(affinity constant),解離常數(shù),平衡透析法確定親和力常數(shù),抗體與單價(jià)抗原的作用,r：表示結(jié)合的抗原濃度與總抗體濃度的比率c：表示游離的抗原濃度n：表示抗體的價(jià)數(shù),親和力的測定,Polyclonal

33、antibody,抗體與多價(jià)抗原的作用,親合力（avidity）一個(gè)抗體與整個(gè)抗原的結(jié)合能力。 親合力大大強(qiáng)于每一位點(diǎn)的親和力，其強(qiáng)度增加不僅僅是親和力的簡單相加，而是呈幾何級(jí)數(shù)上升的。,交叉反應(yīng),交叉反應(yīng)是指不同抗原分子上有相同或相似的抗原決定簇,一種抗體可以與兩種或兩種以上的抗原發(fā)生反應(yīng)。,沉淀反應(yīng),可溶性抗原與抗體結(jié)合，在兩者比例合適時(shí)，可形成較大的不溶性免疫復(fù)合物。在反應(yīng)體系中出現(xiàn)不透明的沉淀物，這種抗原抗體反應(yīng)稱為沉

34、淀反應(yīng)(precipitation reaction)。,凝膠中的沉淀反應(yīng),電泳條件下的沉淀反應(yīng),凝集反應(yīng),顆粒性抗原(如細(xì)菌、紅細(xì)胞或表面帶有抗原的乳膠顆粒)與相應(yīng)抗體結(jié)合，在一定條件下可形成凝集團(tuán)塊的現(xiàn)現(xiàn)象稱為凝集反應(yīng)(agglutination reaction)。,放射免疫測定 (Radioimmunoassay, RIA),酶聯(lián)免疫吸附測定 (ELISA),Western Blotting,免疫沉淀 (immunoprecip