內(nèi)源氣體信號(hào)分子(NO和H2S)對(duì)家禽骨骼肌蛋白代謝的調(diào)控研究.pdf

1、在機(jī)體中，骨骼肌占有相當(dāng)大的比例并發(fā)揮著巨大的調(diào)控作用，因此，骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育不僅關(guān)系著畜禽機(jī)體的健康，還影響著畜禽生產(chǎn)性能的提高。另外，由于骨骼肌是機(jī)體巨大的蛋白周轉(zhuǎn)代謝庫，所以蛋白合成代謝及分解代謝決定著骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育。本研究選擇C2C12細(xì)胞（小鼠）、成肌細(xì)胞（雞）及肉雞作為研究對(duì)象，分別就糖皮質(zhì)激素、一氧化氮（NO）及硫化氫（H2S）氣體信號(hào)分子對(duì)骨骼肌發(fā)育的作用機(jī)制展開研究。
　　第一部分：
　　糖皮質(zhì)激素對(duì)骨骼肌

2、蛋白代謝的調(diào)控研究
　　肌抑素（myostatin，MSTN）是肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的重要調(diào)控因子，影響著骨骼肌細(xì)胞內(nèi)的蛋白合成及分解代謝。本研究利用地塞米松（DEX）處理 C2C12細(xì)胞，初步探索肌抑素蛋白的表達(dá)規(guī)律。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DEX處理24 h后，肌抑素的mRNA豐度出現(xiàn)顯著上調(diào)；當(dāng)DEX處理36 h時(shí)，肌抑素的蛋白表達(dá)水平顯著升高。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)DEX處理顯著抑制C2C12細(xì)胞的蛋白合成率及mTOR/p70S6K信號(hào)通路；而參與蛋白

3、分解代謝的泛素蛋白酶體相關(guān)因子（FoxO1、FoxO3a及MURF1、Atrogin-1）得到激活。因此，我們推測(cè)肌抑素參與了C2C12細(xì)胞的蛋白合成及分解代謝。試驗(yàn)接下來采用肌抑素抑制劑（Follistatin，F(xiàn)s）處理，在培養(yǎng)并分化的C2C12細(xì)胞中，同時(shí)加入DEX及肌抑素抑制劑處理。結(jié)果表明，肌抑素抑制劑處理能夠顯著抑制DEX對(duì)肌抑素的激活以及蛋白分解相關(guān)因子的激活，而對(duì)蛋白合成率及mTOR、p70S6K的作用不顯著?？傊诠?/p>

4、骼肌發(fā)育早期階段，糖皮質(zhì)激素依賴于肌抑素促進(jìn)骨骼肌蛋白分解代謝，影響骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育；并且，肌抑素不是糖皮質(zhì)激素抑制蛋白合成代謝的關(guān)鍵因子。
　　第二部分：
　　氣體信號(hào)分子NO骨骼肌蛋白代謝的調(diào)控機(jī)制研究
　　氣體信號(hào)分子NO參與機(jī)體多種生理活動(dòng)，如血管平滑肌的舒張等，對(duì)機(jī)體的正常運(yùn)轉(zhuǎn)發(fā)揮著重要作用，而精氨酸是內(nèi)源性NO的重要前體物質(zhì)，因此，本研究對(duì)L-Arg-NO途徑在骨骼肌蛋白代謝中的調(diào)控作用進(jìn)行了研究。

5、　　C2C12細(xì)胞：首先，L-Arg處理不僅顯著緩解DEX處理對(duì)骨骼肌細(xì)胞的蛋白合成抑制作用，同時(shí)，相比于對(duì)照組，L-Arg處理能夠顯著上調(diào)C2C12細(xì)胞的蛋白合成率、mTOR（Thr2446）和p70S6K（Thr389）的磷酸化水平。其次，L-NAME（NOS抑制劑）處理能夠顯著抑制C2C12細(xì)胞的蛋白合成率、mTOR（Thr2446）和p70S6K（Thr389）的磷酸化；而L-Arg的添加能夠緩解L-NAME對(duì)蛋白合成率、mTO

6、R（Thr2446）和p70S6K（Thr389）磷酸化水平的抑制作用。另外，研究發(fā)現(xiàn)L-NAME能夠顯著抑制NO的產(chǎn)生及TNOS的活性，并且L-Arg能夠緩解了L-NAME對(duì)NO產(chǎn)生的抑制作用。因此，我們推測(cè)L-Arg-NO途徑參與了C2C12細(xì)胞的蛋白合成代謝過程。最后，研究采用SNP（NO供體）處理C2C12細(xì)胞，NO能夠促進(jìn)骨骼肌蛋白合成代謝，通過激活p-mTOR（Thr2446）、p-p70S6K（Thr389）及p-4E-B

7、P1（Thr37/46）相關(guān)因子的表達(dá)；另外， SNP處理后，細(xì)胞及培養(yǎng)基內(nèi)NO的濃度顯著升高。總之，在C2C12細(xì)胞上，精氨酸依賴于NO氣體信號(hào)分子，激活mTOR/p70S6K信號(hào)通路促進(jìn)蛋白合成代謝；另外，骨骼肌蛋白合成代謝的激活依賴于p-mTOR（Thr2446）的磷酸化而不是p-mTOR（Ser2448）和p-mTOR（Ser2481）。
　　成肌細(xì)胞（雞）：研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的 L-Arg處理均能一定程度地抑制成肌細(xì)胞蛋

8、白合成率。同時(shí)，L-Arg（400μM）處理組蛋白合成率及p70S6K的磷酸化顯著下調(diào)，蛋白分解相關(guān)因子MuRF1及Atrogin-1也受到顯著抑制。并且，在L-Arg處理下，添加L-NAME處理能夠顯著緩解L-Arg對(duì)成肌細(xì)胞（雞）蛋白合成及分解代謝的抑制作用。因此，我們猜測(cè)L-Arg-NO途徑參與了成肌細(xì)胞（雞）蛋白合成及分解代謝過程。最后，試驗(yàn)采用SNP處理成肌細(xì)胞（雞），結(jié)果表明，SNP通過抑制p70S6K的磷酸化，顯著抑制骨骼

9、肌蛋白合成代謝，同時(shí)，顯著地抑制了蛋白分解相關(guān)因子的表達(dá)?？傊诔杉〖?xì)胞（雞）中，L-Arg依賴于NO氣體信號(hào)分子對(duì)蛋白合成及分解代謝呈現(xiàn)顯著的抑制作用。
　　肉仔雞：
　　在上述細(xì)胞試驗(yàn)中，L-Arg-NO途徑均參與了骨骼肌的蛋白代謝過程。因此，本研究假設(shè)了L-Arg-NO途徑同樣參與肉仔雞的骨骼肌蛋白合成代謝過程。試驗(yàn)首先研究了L-NAME處理對(duì)肉仔雞生產(chǎn)性能的影響，結(jié)果表明，L-NAME（0.05％）能夠顯著抑制肉仔

10、雞日增重及空腸、回腸的發(fā)育；而對(duì)胸肌及其指數(shù)無顯著影響，腿肌重量呈現(xiàn)下調(diào)的趨勢(shì)但腿肌指數(shù)無顯著變化。接著，研究采用日糧添加1% L-Arg處理，結(jié)果表明，精氨酸能夠顯著緩解L-NAME對(duì)肉雞的日增重及肉仔雞胸、腿肌重的抑制，而對(duì)胸、腿肌指數(shù)的影響不顯著；同時(shí)，L-Arg一定程度緩解了L-NAME對(duì)胸肌蛋白合成率及mTOR、p70S6K的抑制作用，除p70S6K的磷酸化外，均不顯著；而在腿肌中，L-Arg顯著上調(diào)了蛋白合成率、mTOR、p

11、70S6K蛋白水平。最后，進(jìn)行了嗎多明（NO供體）處理肉仔雞試驗(yàn)，結(jié)果表明，嗎多明處理能夠顯著緩解 L-NAME對(duì)肉雞的日增重及回腸發(fā)育的抑制作用，而對(duì)胸腿肌發(fā)育作用不顯著；在胸腿肌中，嗎多明處理顯著緩解了L-NAME對(duì)蛋白合成率、mTOR、p70S6K蛋白水平上的抑制作用?？傊?，在肉仔雞中，精氨酸至少部分依賴于NO氣體信號(hào)分子調(diào)控肉雞生長(zhǎng)發(fā)育；并且，在此過程中，肉仔雞的生長(zhǎng)發(fā)育并不主要依賴于骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育。
　　第三部分：

12、r>　　氣體信號(hào)分子H2S對(duì)骨骼肌蛋白合成代謝調(diào)控機(jī)制的研究
　　硫化氫（H2S）是機(jī)體內(nèi)重要的氣體信號(hào)分子，能夠參與眾多疾病的發(fā)生、發(fā)展及痊愈等過程，其具有重要的生理學(xué)意義。本研究首先利用DEX處理成肌細(xì)胞（雞）建立蛋白合成下調(diào)模型，添加RU486處理能夠顯著阻斷DEX對(duì)成肌細(xì)胞（雞）蛋白合成代謝的抑制作用，這表明DEX通過糖皮質(zhì)激素受體（GR）對(duì)蛋白合成代謝進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)控；而添加L-Cys處理能夠顯著緩解DEX對(duì)mTOR/p7

13、0S6K信號(hào)通路、蛋白合成率、CSE（胱硫醚-γ-裂解酶）的抑制作用。另外，在L-Cys處理下，添加PAG（CSE抑制劑）處理能夠顯著抑制成肌細(xì)胞（雞）的蛋白合成率、mTOR、p70S6K的磷酸化及CSE的蛋白表達(dá)。因此，我們推測(cè)H2S參與了成肌細(xì)胞（雞）蛋白合成代謝過程。試驗(yàn)接著檢測(cè)了NaHS（H2S供體）對(duì)成肌細(xì)胞（雞）蛋白合成代謝的調(diào)控，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NaHS處理能夠顯著升高培養(yǎng)基內(nèi)H2S的濃度；并且，顯著緩解了DEX對(duì)mTOR/p7

14、0S6K信號(hào)通路、蛋白合成率、CSE的抑制作用。最后，為了進(jìn)一步證明H2S對(duì)蛋白合成代謝的調(diào)控作用，試驗(yàn)采用 Insulin處理建立蛋白合成代謝上調(diào)模型，Insulin處理顯著上調(diào)成肌細(xì)胞（雞）蛋白合成代謝并呈劑量依賴性；添加PAG處理能夠顯著抑制Insulin對(duì)成肌細(xì)胞（雞）的蛋白合成率、mTOR、p70S6K的磷酸化及CSE蛋白表達(dá)的激活作用。總之，糖皮質(zhì)激素及胰島素依賴于CSE/H2S，調(diào)控mTOR/p70S6K信號(hào)通路影響骨骼肌

15、蛋白合成代謝過程。
　　總之：
　　（1）在生長(zhǎng)發(fā)育早期，肌肉生長(zhǎng)抑制素信號(hào)通路參與了糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨骼肌蛋白分解代謝。
　?。?）在C2C12細(xì)胞中，L-Arg-NO促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞的蛋白合成代謝；在成肌細(xì)胞（雞）上，L-Arg-NO抑制了肌細(xì)胞的蛋白合成及分解代謝；在肉仔雞上，L-Arg-NO調(diào)控肉仔雞的生產(chǎn)性能不是直接通過促進(jìn)骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育實(shí)現(xiàn)的。
　?。?）糖皮質(zhì)激素及胰島素依賴于CSE/H2S，激活m