不同異養(yǎng)細菌中H2S代謝及功能研究.pdf

1、硫化氫(H2S)是一種具有臭雞蛋氣味的有毒氣體，存在于多種生產(chǎn)過程以及自然界中。H2S可以通過抑制呼吸鏈而影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)與呼吸系統(tǒng)的活動，是工業(yè)生產(chǎn)中僅次于CO的第二大殺手。20世紀90年代，研究者發(fā)現(xiàn)哺乳動物細胞可以內(nèi)源產(chǎn)生H2S，提示H2S可能具有一定的生理作用。隨著近年來相關(guān)研究的逐漸深入，H2S已被認為是繼CO和NO之后的第三類氣體信號分子。
　　在哺乳動物細胞內(nèi)，H2S主要來源于含硫氨基酸，包括半胱氨酸、甲硫氨酸及胱氨

2、酸，H2S產(chǎn)生過程涉及的酶主要有三個:胱硫醚γ-裂解酶(CSE)、胱硫醚β-合成酶(CBS)與3-巰基丙酮酸硫轉(zhuǎn)移酶(3-MST)。哺乳動物細胞中H2S的過度產(chǎn)生與積累可能會抑制呼吸，產(chǎn)生毒性作用。哺乳動物細胞為了避免體內(nèi)積累過多的H2S，通常會通過酶促氧化將內(nèi)源產(chǎn)生的過量H2S重新氧化為硫代硫酸鹽。H2S的氧化過程主要涉及三個酶:硫醌氧化還原酶(SQR)、硫轉(zhuǎn)移酶(RHOD)和過硫化物雙加氧酶(PDO)。
　　自養(yǎng)細菌中H2S的

3、氧化途徑及其在能量代謝中的作用已經(jīng)得到了較為深入的研究。已報道的SQR主要分布于化能自養(yǎng)菌及光合硫氧化細菌中，可以分為六類。在革蘭氏陰性自養(yǎng)細菌中發(fā)現(xiàn)了兩種類型的PDO，能夠催化相同的底物，序列相似性較高，在革蘭氏陽性自養(yǎng)細菌中發(fā)現(xiàn)另外一類PDO，與革蘭氏陰性自養(yǎng)細菌中兩類PDO的序列相似性較低，且作用底物不同。本實驗室前期研究證實，異養(yǎng)細菌中同樣含有SQR、PDO及RHOD的編碼基因，而且上述蛋白同樣在硫化物的氧化代謝中發(fā)揮作用。例如

4、實驗室前期發(fā)現(xiàn)在異養(yǎng)細菌Cupriavidus pinatubonensis JMP134中，SQR首先氧化硫化物生成多硫化物，多硫化物與GSH發(fā)生自發(fā)反應(yīng)生成GSSH，然后PDO氧化GSSH生成亞硫酸鹽，生成的亞硫酸鹽會與多硫化物發(fā)生自發(fā)反應(yīng)生成硫代硫酸鹽，RHOD能夠加速多硫化物與GSH的反應(yīng)。
　　基于上述研究，推測與哺乳動物細胞內(nèi)類似,H2S的產(chǎn)生與代謝可能廣泛存在于細菌中且具有一定的生理作用。本文首先通過生物信息學手段對

5、已全基因組測序的細菌及古菌中的SQR及PDO進行分析，確定SQR及PDO編碼基因廣泛存在于不同的細菌與古菌中，也有部分細菌與古菌中不含SQR及PDO編碼基因?？紤]到自養(yǎng)細菌中H2S的代謝已經(jīng)研究的較為深入，本文針對異養(yǎng)細菌中H2S的產(chǎn)生及代謝開展了后續(xù)研究。具體研究對象為C.pinatubonensis JMP134、Pseudomonas aeruginosa PAO1與Escherichia coli BL21(DE3)，其中E.c

6、oli BL21(DE3)基因組中不含SQR及PDO編碼基因;C.pinatubonensis JMP134基因組中含SQR及PDO編碼基因，且SQR及PDO編碼基因位于同一個操縱子上;P.aeruginosa PAO1基因組中含SQR及PDO編碼基因，但SQR及PDO編碼基因在基因組上相距較遠。通過對上述菌株中SQR及PDO編碼基因進行敲除、回補、過表達及H2S氧化能力分析，發(fā)現(xiàn)異養(yǎng)細菌中SQR及PDO能夠代謝自身產(chǎn)生的H2S，因而含

7、有SQR及PDO的菌株在培養(yǎng)過程中并不積累和釋放H2S;在混合培養(yǎng)過程中，含有SQR及PDO的菌株能夠代謝其他菌株釋放的H2S。同時以P.aeruginosa PAO1為代表性菌株，對異養(yǎng)細菌中H2S產(chǎn)生途徑進行了研究，確認P.aeruginosa PAO1中既含有催化有機硫化物生成H2S的三個酶CBS、CSE及3-MST，也含有催化無機硫化物生成H2S的業(yè)硫酸鹽還原酶。經(jīng)過對P.aeruginosa PAO1中已知的H2S合成與代謝相

8、關(guān)基因的順序敲除，得到如下菌株:H2S代謝相關(guān)基因敲除菌株P(guān)a3K（Pa△sqr1△sqr2△pdo）、H2S合成相關(guān)基因敲除菌株P(guān)a△H2S（Pa△cbs△cse△mst△cysI）、H2S合成與代謝相關(guān)基因敲除菌株P(guān)a7K(△cbs△cse△mst△cysI△sqr1△sqr2△pdo)。Pa7K既不含有H2S生成基因也不含有H2S代謝基因，在豐富培養(yǎng)基LB中的生長并未受到影響，也不向外釋放H2S。如果向LB培養(yǎng)基中添加過量的半胱氨

9、酸，Pa7K仍然會產(chǎn)生大量H2S，說明P.aeruginosa PAO1通過有機途徑產(chǎn)生H2S的過程比較復雜，除了已報道的合成相關(guān)蛋白外，還存在其他未知的可催化H2S產(chǎn)生的酶;在添加過量無機硫源的無機鹽培養(yǎng)基中，Pa7K不再產(chǎn)生并積累H2S，說明P.aeruginosa PAO1通過無機硫源產(chǎn)生H2S的途徑較為單一，其中關(guān)鍵酶為亞硫酸鹽還原酶。
　　通過對不同異養(yǎng)細菌中H2S代謝相關(guān)基因的比較基因組學分析，發(fā)現(xiàn)Cupriavidu

10、s necator H16基因組中不含有SQR編碼基因sqr，但其在培養(yǎng)過程并不釋放H2S。對C.necator H16基因組的進一步分析發(fā)現(xiàn)，該菌株含有編碼黃素細胞色素硫脫氫酶(FCSD)的fccAB基因。FCSD在光合細菌中有報道，包含一個大的能夠結(jié)合硫的黃素蛋白亞基(FccB)和一個小的cytochrome c亞基(FccA)，其體外功能與SQR類似，能夠氧化硫化物生成零價硫，與SQR不同之處在于，F(xiàn)CSD氧化硫化物過程中生成的電

11、子會傳遞給cytochrome c。目前關(guān)于FCSD是否在體內(nèi)可以行使與SQR類似的催化硫化物氧化的功能并未確定。本文對C.necator H16中FCSD編碼基因進行了敲除、回補、過表達及H2S氧化能力分析，實驗結(jié)果顯示，F(xiàn)CSD能夠代謝C.necator H16內(nèi)源產(chǎn)生的H2S，突變菌株Cn△fccAB喪失了H2S代謝能力并向外釋放H2S。在P.aeruginosa PAO1的H2S代謝相關(guān)基因敲除菌株P(guān)a3K(Pa△sqr1△sq

12、r2△pdo)中對fccAB過表達，發(fā)現(xiàn)FCSD在Pa3K中也具有氧化硫化物的活性，而且與SQR類似，F(xiàn)CSD氧化H2S產(chǎn)生的多硫化物也包含二硫化物和三硫化物。進一步在Pa3K中對fccAB與pdo進行共表達，發(fā)現(xiàn)FCSD與PDO能夠協(xié)同代謝H2S。具體過程為:FCSD氧化H2S生成多硫化物，多硫化物與GSH自發(fā)反應(yīng)生成GSSH，接下來GSSH在PDO的作用下氧化生成亞硫酸鹽，生成的亞硫酸鹽能夠與多硫化物發(fā)生反應(yīng)生成硫代硫酸鹽，該途徑與

13、C.pinatubonensis JMP134中SQR/PDO氧化硫化物的途徑類似，區(qū)別在于C.necator H16并不含有加速多硫化物與GSH反應(yīng)的RHOD。生物信息學分析顯示，在已全基因組測序的4929株細菌中，有190個菌株含有FccB，且大部分fccB與fccA在基因組上相鄰排列。FccBs可以分為三類，每一類在進化上都是相對保守的。
　　P.aeruginosa是一種革蘭氏陰性條件致病菌，廣泛分布于不同生境之中。P.a

14、eruginosa PAO1基因組中含有cbs、cse、mst、cysI等H2S合成相關(guān)基因，以及sqr與pdo等H2S代謝相關(guān)基因。為了進一步了解H2S產(chǎn)生與代謝在異養(yǎng)細菌中的生理功能，接下來對P.aeruginosa PAO1及其各突變菌株的幾個代表性表型:綠膿菌素的產(chǎn)生、生物膜的形成、運動性、血平板上的菌落形態(tài)、鼠李糖脂的產(chǎn)生及致病能力等進行了系統(tǒng)研究。實驗結(jié)果顯示，P.aeruginosa PAO1和H2S代謝相關(guān)基因敲除菌株P(guān)

15、a3K(Pa△sqr1△sqr2△pdo)表型基本相同，而H2S合成相關(guān)基因敲除菌株P(guān)a△H2S(Pa△cbs△cse△mst△cysI)和H2S合成與代謝相關(guān)基因敲除菌株P(guān)a7K(△cbs△cse△mst△cysI△sqr1△sqr△pdo)表型基本相同，說明H2S合成而非H2S的代謝對P.aeruginosa PAO1的各類表型會產(chǎn)生影響。具體而言，P.aeruginosa PAO1內(nèi)H2S合成相關(guān)基因的缺失，嚴重影響了該菌株綠膿菌

16、素的產(chǎn)生、運動能力、鼠李糖脂的產(chǎn)生等表型，且H2S合成相關(guān)基因突變菌株對萵苣葉柄的感染能力顯著下降。對P.aeruginosa PAO1及H2S合成相關(guān)基因敲除菌株P(guān)a△H2S（Pa△cbs△cse△mst△cysI）進行轉(zhuǎn)錄組學分析，結(jié)果顯示H2S合成相關(guān)基因的缺失影響了P.aeruginosa PAO1的群體感應(yīng)系統(tǒng)，考慮到前述表型多受群體感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)控，推測H2S合成基因的缺失首先導致P.aeruginosa PAO1喪失H2S合