動物微生物-病毒的雞胚接種技術(shù)實(shí)驗四

1、一、原理 雞胚為活的動物機(jī)體，組織分化程度低，病毒易于增殖，可選擇不同的日齡和接種途徑，感染病毒的組織和液體中含大量病毒。,實(shí)驗四 雞胚接種,二、實(shí)驗?zāi)康?了解雞胚的基本結(jié)構(gòu)與功能，掌握常用的雞胚接種方法。,三、雞胚的結(jié)構(gòu)與功能,卵殼殼膜氣室絨毛尿囊膜,尿囊腔羊膜與羊膜腔卵黃卵白,,卵殼殼膜,上有細(xì)孔，進(jìn)行氣體交換,使氣體分子和液體分子在內(nèi)外兩方面進(jìn)行交換。,氣室 絨毛尿囊膜,呼吸和調(diào)節(jié)壓力,起胚胎呼

2、吸器官的功能，氧氣的交換是在膜的血管內(nèi)通過卵殼孔而進(jìn)行的。,尿囊腔,胚胎的排泄器官，內(nèi)含有尿囊液，初為透明液體，是單純生理鹽溶液，以后尿囊液中尿酸鹽迅速增加，胚胎發(fā)育到第12-13天后，尿囊液開始變得混濁。,羊膜與羊膜腔卵黃 卵白,其中盛有羊水，胎體浸泡于其中,在胚胎發(fā)育早期供給雞胚營養(yǎng)。在胚胎發(fā)育晚期供給雞胚營養(yǎng)。,四、材料1、雞胚 10日齡2、病毒 雞新城疫病毒（NDV）3、照蛋燈4、打孔器5、石蠟6、注射

3、器7、蛋座8、酒精棉球、碘酊棉球,五、受精卵的選擇,最好是來自SPF雞群，以降低母源抗體的影響受精卵的殼最好是白色的受精卵必須新鮮，保存在5-20℃不要超過10天，保存一個月的受精卵，孵化率將近于零。,六、孵育,孵卵箱內(nèi)的溫度應(yīng)保持在37.5-38.5℃相對濕度：50%-60%必須保證有充分的新鮮空氣流通，特別是在孵化5-6天以后從孵育后第3天開始，每天翻卵一次。,七、檢卵,自孵育后的第4天開始檢卵，每天一次。孵育4-5

4、日于檢卵燈上檢查雞胚受精與否及發(fā)育情況。未受精卵：只見模糊的卵黃陰影，不見血管和雞胚痕跡活胚：具有清晰的血管和雞胚暗影，較大雞胚還可見到胚動，但孵育14、15天以后胚動不明顯，甚至無胚動。死胚：血管昏暗模糊，沒有胚動。,八、接種前處理,用檢卵燈再次檢查雞胚活力，用鉛筆畫出氣室和胚胎的位置，并在將要接種的部位做好記號。對雞胚進(jìn)行消毒。,九、雞胚用于病毒培養(yǎng)的優(yōu)缺點(diǎn)（一）優(yōu)點(diǎn),組織分化程度低，病毒易于增殖可選擇不同的日齡和接種途

5、徑感染病毒的組織和液體中含大量病毒容易采集和處理來源充足設(shè)備和操作簡便易行,（二）缺點(diǎn),胚內(nèi)可能污染細(xì)菌和病毒 沙門氏菌、禽白血病病毒、新城疫、禽腦脊髓炎病毒母源抗體許多病毒在雞胚中增殖缺乏特異性的感染指針,十、接種途徑1、尿囊腔接種2、絨毛尿囊膜接種 3、卵黃囊接種4、眼球接種5、羊膜腔接種 正粘病毒和副粘病毒6、腦內(nèi)接種 狂犬病毒7、靜脈接種 藍(lán)舌病毒,（一）卵黃囊接種法

6、 主要用于蟲媒披膜病毒以及鸚鵡熱衣原體和立克次氏體等的分離和增殖。方法一：1）取6-8日齡雞胚，用檢卵燈照視畫出氣室和胚胎位置后，垂直放置在卵座上(大頭向上),2）用碘酊和酒精消毒氣室端3）用鋼錐在氣室中央錐一小孔,4） 用注射器吸取病毒懸液，沿氣室端所穿小孔垂直刺入3cm，注入0.1-0.5ml病毒液。5）用熔化的石蠟封孔，置孵卵箱內(nèi)繼續(xù)孵育，每天翻卵1-2次，24h內(nèi)死亡者廢棄。,4）用鋼錐打一小孔，將針頭刺入約1

7、.5cm，注入病毒液0.1-0.5ml5）用熔化的石蠟封孔，置孵卵箱內(nèi)繼續(xù)孵育，24h內(nèi)死亡者廢棄,方法二：1）2）同一3）將卵橫放在卵座上，胚胎位置向下。在卵長徑的1/2處用碘酊和酒精消毒。,（二）絨毛尿囊膜接種 主要用于痘病毒和皰疹病毒的分離和增殖。方法一：1）取10-12日齡雞胚，畫出氣室部，消毒2）在氣室端的卵殼上開一1.5×1.5cm的口3）用滅菌眼科鑷子撕去一小片內(nèi)殼膜4）滴入接種物5）用

8、膠布或透明膠紙封閉切口,方法二：（要做人工氣室）1、在胚胎附近近氣室處，選擇血管較少的部位，用電烙器在卵殼上烙一個直徑約3-4mm的烤焦圈。,2、用碘酊和酒精消毒后，小心用刀尖撬起卵殼，造成卵窗。3、在氣室端中央鉆一個小孔。4、用針尖挑破卵窗中心的殼膜，切勿損傷其下的絨毛尿囊膜，滴加生理鹽水于刺破處。,5、用橡皮乳頭緊貼于氣室中央小孔上吸氣，造成氣室內(nèi)負(fù)壓，使卵窗部位的絨毛尿囊膜下陷而形成人工氣室，此時可見滴于殼膜上的生理鹽水迅速

9、滲入。6、用1ml注射器滴2-3滴接種物于絨毛尿囊膜上。,7、用透明膠紙封住卵窗，或用玻璃紙蓋于卵窗中，周圍涂上熔化的石蠟密封，氣室中央的小孔用石蠟密封。8、胚橫臥于卵箱中，不許翻動，保持卵窗向上。,（三）  尿囊腔接種 主要用于正粘病毒和副粘病毒，如流感病毒、新城疫病毒的分離和增殖。1、選用10-11日齡的雞胚，畫出氣室和胚位2、在氣室接近胚體處用碘酊和酒精進(jìn)行消毒3、用鋼錐穿一小孔4、將注射器沿小孔插

10、入0.5-1.0cm，注入0.1-0.2ml接種物5、用石蠟封口，并置孵卵箱中孵育，每天翻卵并檢卵一次，24h內(nèi)死亡者廢棄。,十一、NDV接種雞胚后對雞胚的影響 NDV以尿囊腔接種于9-10日齡雞胚，強(qiáng)毒株在30-60h死亡，弱毒株3-6d死亡。死亡的雞胚以尿囊液含毒量最高，胚胎全身出血，以頭部、足趾、翅膀出血尤為明顯。,十二、收毒 收毒前將雞胚直立放置于4℃冰箱半小時以上，凍死胚胎，防止出血。 根據(jù)接種途徑的不同