免疫抗體

1、免疫球蛋白( Immunoglobulin, Ig ),1890年，Behring 和北里在德國Koch實驗室從豚鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了第一種抗體：白喉抗毒素，從而挽救了成千上萬的白喉患兒，死亡率從60%降到26%。 獲1901年的第一屆諾貝爾獎。,抗體的發(fā)現(xiàn),一、概述: Ig分子是機體中最神奇的、在結(jié)構(gòu)上變換無窮的一類分子。它只由3個基因編碼，但卻產(chǎn)生100億以上不同序列的蛋白質(zhì)分子，應(yīng)對數(shù)以億計的病原微生物和異己分子。

2、,概念,概念,4,與Ig 有關(guān)的諾貝爾獎獲得者,◆ Ig基因重排發(fā)生在B細胞 Ig來源于B細胞◆ Ig具有基本的4肽鏈結(jié)構(gòu) 由重鏈及輕鏈組成異源二聚體◆ Ig基因重排是Ig表達的前提 可變區(qū)具有無限的多樣性◆ Ig是重要的免疫分子 作為BCR識別抗原與發(fā)揮

3、抗體活性,經(jīng)典Ig的概念,免疫球蛋白：具有抗體活性或結(jié)構(gòu)的球蛋白。 抗體是免疫球蛋白，但免疫球蛋白不一定都有抗體活性。 抗體:主要是B細胞在抗原刺激后，增殖分化為漿細胞所產(chǎn)生的能與相應(yīng)抗原特異結(jié)合的糖蛋白，是體液免疫的效應(yīng)分子。,根據(jù)亞細胞定位Ig分為膜型及分泌型，膜型的稱之為B細胞抗原識別受體（B cell receiptor, BCR); 分泌型稱之為抗體（antibody),B細胞分化為漿細胞，產(chǎn)生抗體,B細胞缺失導致外

4、周血Ig減少，體液免疫功能低下，易感染。,抗體的理化性質(zhì)單體Ig的分子量為150kDa-170kDa；糖基化修飾（糖蛋白）；電泳泳動位置主要為?球蛋白；對熱相對穩(wěn)定，（IgE除外）；具有高度不均一性。,二、 免疫球蛋白的基本結(jié)構(gòu),（一）基本結(jié)構(gòu) 1、四肽鏈結(jié)構(gòu)經(jīng)二硫鍵共價結(jié)合2條重鏈和2條輕鏈,Edelman發(fā)現(xiàn)抗體的重鏈和輕鏈結(jié)構(gòu),抗體的結(jié)構(gòu),還原劑,分子篩還原劑,2、重鏈（heavy chain, H）

5、 輕鏈（light chain, L）,,重鏈：450－550aa, 50－75kDa；（Heavy chain）：分為5類? （gamma） —IgG?（mu ） —IgM?（alpha） —IgA?（epsilon ） —IgEδ（delta） —IgD亞類：IgG1-4、IgA1-2,5類抗體的結(jié)構(gòu)模式圖,輕鏈：214aa, 25kDa； 根據(jù)其恒定區(qū)aa組成和排列順序

6、（抗原性）不同，分為2型（type）：?，?； 亞型： ?：? 1－4。 一個天然Ig上的兩條輕鏈的型別是相同的； 每個Ig只選用1個型別的輕鏈（?或?)，二者功能相同。 人： ?：?為2：1； 小鼠： ?：?為20：1。,3、蛋白酶水解片段,,,,,,,-S-S-,S-S,S-S,N,N,C,,,,L,H,VL,CL,VH,CH1,CH2,CH3,,,,,木瓜蛋白酶（papain）2 Fab，1 Fc,胃

7、蛋白酶（pepsin）F(ab’)2, pFc,Porter發(fā)現(xiàn)Ig的Fab和Fc段,,抗體的特異性,輕鏈及重鏈可變區(qū)共同決定抗體的特異性,可變區(qū)（Variable region） VL(N-L1/2);VH (N-C1/4) 恒定區(qū)（constant region) CL(C-L1/2); CH, (C-C3/4),4、功能區(qū)和結(jié)構(gòu)域：兩條重鏈和兩條輕鏈都可折疊為數(shù)個球形結(jié)構(gòu)域或功能區(qū)，每個結(jié)構(gòu)域一般具有相應(yīng)的功能。,1

8、)可變區(qū)（variabl region,VH，VL）,高變區(qū)（hypervariable　region, HVR）或互補決定區(qū)( complementary determining region, CDR)： VH和VL中直接與抗原接觸結(jié)合、氨基酸組成和序列高度可變的區(qū)域； 骨架區(qū)（framework region；FR）： 其余區(qū)域為骨架區(qū),,,,,FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3

9、 FR4,V區(qū),2）恒定區(qū)（constant region, CH ，CL區(qū)）,（1）CH ，CL;（2）?和?的C區(qū)長度基本一致；（3）?、 ?、 ? 的C區(qū)包括CH1，2，3； 而 ? ， ?則含有CH1，2，3，4。（4）針對不同抗原的同一類Ig，其V區(qū)不同，但 C區(qū)相同； 而針對同一抗原表位的不同類Ig，其V區(qū)相 同，C區(qū)不同。,5、鉸鏈區(qū) （hinge region）,

10、1）位于CH1-CH2之間，富含Pro；2）具有柔韌性，可折疊分別形成T型和Y型3）易被蛋白酶水解；4）IgG1，2，4和IgA鉸鏈區(qū)短； IgG3，IgD鉸鏈區(qū)長； IgM，IgE無。,（二）Ig的其它成分,1、J鏈（join chain，J chain） 1)漿細胞合成； 2)富含半胱氨酸； 3)連接2聚體IgA、5聚體IgM。,,,,,,,,,,,,,,IgA J chain,2、分泌片（se

11、cretory piece, SP） 1)粘膜上皮細胞合成、分泌； 2)只存在于粘膜分泌型IgA中； 3)作用：保護IgA免受蛋白酶降解； 介導分泌型IgA從粘膜 粘膜表面,IgA SC,,三、Ig序列的保守性,盡管Ig在進化過程中其恒定區(qū)相對保守，但不同種屬間及相同種屬不同個體間的相同類型Ig存在序列差異，該結(jié)構(gòu)可以在不同種屬間構(gòu)成免疫原性；同一個體不同Ig分子之間也構(gòu)成免疫原性。,,,,

12、,,,,,,,,,Ag1,Ab1（Ag2）,Ab2,1、同種型（Isotype） 同一種屬所有個體均具有的Ig抗原，主要存在于重鏈和輕鏈的穩(wěn)定區(qū)中,,,,2、同種異型（allotype，allotope） 同一種屬不同個體所具有的Ig抗原，主要存在于重鏈和輕鏈的穩(wěn)定區(qū)中，由IgC區(qū)內(nèi)一個或數(shù)個氨基酸殘基的差異所致。如 IgG： GM1，GM2，GM3，GM4... IgA: AM1, AM2 ?

13、鏈：KM1，KM2，KM3同種異型為個體型標志，又稱同種異型遺傳標志。,Allotypic Determinants,,（三）獨特型（ idiotype, Id） 同一個體不同Ig的抗原，主要存在于Ig 的V區(qū)。是指每個免疫球蛋白分子可變區(qū)肽鏈所具有的抗原特異性標志（獨特位，5-6個）。一定條件下獨特型表位可刺激機體產(chǎn)生抗獨特型抗體，這對免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)有重要意義。 Jerne 的免疫網(wǎng)學說（Immune network the

14、ory）的中心是獨特型免疫調(diào)節(jié)。,Idiotypic Determinants,Ig的不均一性,數(shù)十種,四、五類Ig的特性及功能,Ig 分為五類（Class）： IgG, IgM, IgA, IgE, IgD 其中IgG, IgA存在亞類（Subclass）： IgG1，2，3，4； IgA1，2,（一）IgG：單體；含量最高；半衰期20-23，可通過胎盤，一般是高親和力抗體，是免疫功能最強的Ig分子；在免疫應(yīng)答中起

15、著激活補體，中和多種毒素的作用。是唯一能在母親妊娠期穿過胎盤保護胎兒的抗體。主要參與抗感染免疫；可引起介導免疫病理損傷。,IgG1、IgG3、IgG4可穿過胎盤屏障，在新生兒抗感染免疫中起重要作用；IgG1、IgG3可高效激活補體，并可與巨噬細胞、NK細胞表面Fc受體結(jié)合，發(fā)揮調(diào)理作用、ADCC作用等；某些自身抗體和引起二、三型超敏反應(yīng)的抗體也屬于IgG。,（二） IgM： 含CH4（C?4）； 膜結(jié)合型：單體，BCR

16、； 分泌型：五聚體，分子最大，作用最強（結(jié)合抗原；激活補體）； 最早出現(xiàn)的抗體（個體發(fā)育；免疫應(yīng)答）。,免疫球蛋白的進化,血清型IgM,主要參與抗感染免疫，補體依賴的細胞毒效應(yīng)（比IgG強500倍）；識別并殺傷腫瘤細胞；識別并清除凋亡及衰老的細胞。 中和低密度脂蛋白防止動脈粥樣硬化的發(fā)生。 是機體的忠實衛(wèi)士。,（三）IgA： 血清型：單體； 分泌型：雙聚體；呼吸道、消化道、乳腺等

17、產(chǎn)生，外分泌液中的主要成分，在粘膜抗感染免疫中起中和作用； 初乳中含sIgA。,sIgA的結(jié)構(gòu),,分泌型IgA的形成,IgA在腸道的免疫保護效應(yīng),（四）IgD 單體，主要存在于B細胞表面（mIgD）， mIgD是成熟B細胞的標志。,（五）IgE 單體形式，含CH4（C?4），體內(nèi)含量最低。 參與抗寄生蟲免疫，發(fā)揮ADCC效應(yīng)； 參與速發(fā)型超敏反應(yīng)（4）。,（一）識別并結(jié)合抗原---中和作用，主要功能（V

18、區(qū)）（二）活化補體；（三）調(diào)理作用；（四）ADCC；（五）通過胎盤（IgG）和粘膜(分泌型IgA)。（六）免疫病理,五、抗體的生物學活性,抗體與抗原特異性結(jié)合發(fā)揮免疫效應(yīng),抗體的中和作用（neutralization）1、V區(qū)特異結(jié)合抗原；中和毒素，阻斷病原入侵；2、單體Ig：2價； 分泌型IgA：4價；IgM：理論價10；實際5。,補體依賴的細胞毒作用（Complement-dependent cytotoxity）,

19、抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用（Antibody-dependent cellular mediated cytotoxity， ADCC）效應(yīng),調(diào)理吞噬,參與免疫病理作用：I 、II、III型變態(tài)反應(yīng)參與免疫復(fù)合物形成（Immune complex）,六、抗體的多樣性,抗體多樣性（diversity）是指不同抗體的V區(qū)結(jié)構(gòu)多種多樣，能針對任何不同的抗原特異結(jié)合。,,Susumu Tonegawa發(fā)現(xiàn)Ig的基因重排 Nobel

20、 Prize 1987,利根川進認為，“不敢冒險的人，或者只會考試得分的人，是不適合于搞科研的”，“科學家的最重要的才能是要有懷疑的能力，要有豐富的想象力”。,利根川進 (日，S.Tonegawa)：20世紀70年代他進一步闡明了免疫球蛋白的基因結(jié)構(gòu)，證實了其基因的重排和突變是抗體多樣性的根據(jù)，使免疫球蛋白多樣性的遺傳控制找到了依據(jù)。,抗體的基因結(jié)構(gòu)及重排的發(fā)現(xiàn),Ig Gene Location,?Heavy,?kappa,?lambd

21、a,人胚系基因中Ig基因片段,V片段（Variable segment）D（Diversity segment）J片段（Jioning segment）,重鏈V區(qū)的VDJ 重排（Rearrangement） 輕鏈V區(qū)的VJ 重排,重鏈可變區(qū)的VDJ重組,輕鏈基因胚系及重排后結(jié)構(gòu),68,Ig基因可變區(qū)重排的兩個必要條件,（1）重組信號序列（recombination signal sequences, RSS）: 由七聚

22、體、九聚體以及兩者間的間隔序列組成 在各基因片段兩側(cè)存在（2）重組活化酶(recombinase) 由重組活化基因（RAG）編碼 有RAG-1和RAG-2兩種 RAG出現(xiàn)于B細胞發(fā)育早期,重排信號序列RSS（recombination signal sequence）,69,,,Vκ region,J κ region,,,,,,,通過RSS形成莖襻狀結(jié)構(gòu),抗體多樣性產(chǎn)生的機制,組合引起的多樣性：眾多的片斷的隨機組合。

23、 連接引的多樣性起: VDJ連接處的不準確連接和核苷酸插入，即連接處核酸的丟失或加入。 體細胞突變: 發(fā)生在抗原刺激后的成熟的B細胞已經(jīng)重排過的V基因，常見于CDR區(qū)，特別是CDR3。主要是點突變。B細胞的V區(qū)基因突變進一步增加V區(qū)的多樣性。體細胞突變可導致抗體親和力成熟。,72,重排造成的多樣性,1.抗原誘導前（天然發(fā)生的）,,73,2.連接造成的多樣性：即V(D)J重組時接頭處的變化，出現(xiàn)N區(qū)和P核苷酸的插入,V-regi

24、on N1 P D-region N2 J-region tgtgcgaga.. tgggatg ...........ttatgattggattttata.. cagc .......tgactactgg tgtgcgaga.. tgggatg

25、..........ttatgattggattttata.. cagc .......tgactactgg tgtgcgaga.. tgggatg ...........ttatgattggattttata.. cagc .......tgactactgg tgtgcgaga.. tgg ...

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27、ttggattttata.. cagc　　　 .......tgactactgg tgtgcgaga.. tgggatg ...........ttatgattggattttata.. cagc 　　　.......tgactactgg tgtgcgaga.. tgggatg ...........ttatgattggattttata..

28、 cagc .......tgactactgg tgtgcgaga.. tgggatg ...........ttatgattggattttata.. cagc .......tgactactgg tgtacca.... caaacctga ac gtattactatggttcggggacc

29、ga....... accccc ........gactactggtgtacca.... caaacctga ac gtattactatggttcggggaccga....... accccc ........gactactggtgtgcgaaag. tg c ggtatagtgagagttacta.

30、 .......tgactcttgg tgtgcgaaag. tg c ggtatagtgagagttacta. .......tgactcttgg,74,體細胞高突變: 成熟B細胞經(jīng)抗原刺激后發(fā)生的序列高頻率隨機突變，局限于V區(qū)，多發(fā)生于CDR區(qū)，其中RGYW（R＝A/G，Y＝C/T，W＝A/T）基序是突變的一個規(guī)律；與Ig

31、親和力成熟相關(guān)。,主要是體細胞高突變(somatic hypermutation),3.抗原誘導的V區(qū)序列的改變,抗體分子多樣性,IGH IGK IGL基因片段的組合 V 50 40 30 D

32、 23 J 6 5 7 V×D×J 6900 300 210IgH/Igk(Igl)鏈的組合

33、 6900×（300＋210）≈3.5 ×106 不準確連接 多樣性至少增加3000倍 核苷酸插入 多樣性增加100倍 可能的組合 1011--- 1012 重排基因的高頻突變 突變頻率是其它基因的100萬倍以上

34、 （導致抗體的親和力成熟）,,,,,76,Ig基因同型排斥（isotype exclusion）,77,Ig基因等位排斥（Allelic exclusion ）,（一）多克隆抗體；（二）單克隆抗體；（三）基因工程抗體。,七、抗體的制備,利用抗原免疫動物后從血清中獲得的抗體，含有針對不同抗原表位（epitope）的多種類型抗體。,Ag,,,,,,

35、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,（一）多克隆抗體（polyclonal antibody）,（二）單克隆抗體（Monoclonal antibody） Köhler 和 Milstein 75年建立的技術(shù)，通過雜交瘤技術(shù)獲得的針對單一抗原決定簇的高特異性抗體。,Köhler(1946-1995),Milstein(1927-2002),,,,,,,,,,雜交瘤細胞1,雜交瘤細胞2,雜交瘤細胞3,,,

36、,Mab1,Mab2,Mab3,Ag,,,,,,,,,,,,,,,,,,單抗的主要優(yōu)點： 高純度、高特異性、高產(chǎn)量；單抗的主要應(yīng)用： 免疫檢測、診斷、治療及基礎(chǔ)研究等。,（三） 基因工程抗體（Genetically engneering antibody） 利用基因重組技術(shù)在工程細胞（如大腸桿菌、酵母菌、哺乳動物細胞等）生產(chǎn)的高特異性抗體，可對抗體V區(qū)改造，使其提高親和力，將小鼠抗體的穩(wěn)定區(qū)置換為人抗體，成為人源

37、化嵌合抗體。,基因工程抗體構(gòu)建的基本步驟,克隆Ig基因片段 (通過PCR擴增或探針雜交篩選IgV區(qū)基因) 構(gòu)建克隆基因的表達載體 導入真核或原核細胞使之表達 并篩選出有功能活性的重組抗體,,,,基因工程嵌合抗體,產(chǎn)生人源抗體的小鼠,七、Ig的檢測,主要利用Ig具有抗原性的特點，利用免疫化學技術(shù)和免疫標記技術(shù)進行檢測。,,,,,Ag,10Ab,20