菌種保藏

1、微生物實(shí)驗(yàn)菌種保藏方案微生物實(shí)驗(yàn)菌種保藏方案一、石蠟油低溫保藏法一、石蠟油低溫保藏法本方法的原理是在長(zhǎng)好的斜面菌上覆蓋滅菌的液體石蠟，達(dá)到菌體與空氣隔絕，使菌處于生長(zhǎng)和代謝停止?fàn)顟B(tài)，同時(shí)石蠟油還防止水分蒸發(fā)，在低溫下達(dá)到較長(zhǎng)期的保藏菌種的目的。保藏溫度要求在4～4℃下。液體石蠟法適用于不產(chǎn)孢子的菌種。具體操作是：菌種為斜面培養(yǎng)菌種，斜面不宜過長(zhǎng)；選擇純凈優(yōu)質(zhì)石蠟油，置三角燒瓶中經(jīng)過121℃高壓蒸汽滅菌1～2h，將其放烘箱中(160℃左右

2、)干熱處理，去除滅菌時(shí)滲入的水分，待石蠟油變得清澈透明后冷卻即可加入斜面，斜面上不能出現(xiàn)氣泡，液蠟添加量以高出斜面頂部約1cm為宜。二、甘油管冷凍保藏法二、甘油管冷凍保藏法1試驗(yàn)方法介紹本法也是利用微生物在甘油中生長(zhǎng)和代謝受到抑制的原理達(dá)到保藏目的。其方法是，將80%的甘油高壓蒸汽滅菌待用。將培養(yǎng)好的斜面菌種用無菌水制成高濃度的菌懸液(108～1010ml)。取1ml滅菌甘油放入與甘油充分混勻，使甘油濃度約為10%30%，于70℃下凍存

3、。20℃保存時(shí)間較短?；虿捎皿w積比為8：2的甘油－生理鹽水，加入新鮮培養(yǎng)的菌體肉湯，混合均勻后至20℃冰箱保存。2效果該法適用于一般細(xì)菌的保存，同時(shí)也適用于鏈球菌、弧菌、真菌等需特殊方法保存的菌種，適用范圍廣，操作簡(jiǎn)便，效果好，無變異現(xiàn)象發(fā)生。甘油－生理鹽水保存液保存菌種優(yōu)于甘油原液，其原因可能是加入生理鹽水適當(dāng)降低了甘油的高滲作用，且有肉湯培養(yǎng)物適量增加保存液的營養(yǎng)成分，從而更好地保護(hù)了待保存的菌株。三、真空冷凍干燥法三、真空冷凍干燥

4、法1試驗(yàn)原理真空冷凍干燥保藏法是兼具低溫、干燥、除氧三方面菌種保藏的主要因素，除不宜于絲狀真菌的菌絲體外，對(duì)病毒、細(xì)菌、放線菌、酵母及絲狀菌孢子等各類微生物都適用，不宜用凍干法保存的微生物不到2%。冷凍干燥法是在低溫下快速將細(xì)胞凍結(jié)，然后在真空條件下干燥，使微生物的生長(zhǎng)和酶活動(dòng)停止。為了防止在冷凍和水分升華過程中對(duì)細(xì)胞的損害，要采用保護(hù)劑來制備細(xì)胞懸液，使菌在凍結(jié)和脫水過程中起到保護(hù)作用的溶質(zhì)，通過氫鍵和離子鍵對(duì)水和細(xì)胞所產(chǎn)生的親和力來

5、穩(wěn)定細(xì)胞成分的構(gòu)型。即是使樣品中的水分在冰凍狀態(tài)下，抽真空減壓，使凍結(jié)的冰直接升華為水蒸氣，使樣品達(dá)到干燥。干燥后的微生物在真空下封裝，與空氣隔絕，達(dá)到長(zhǎng)期保藏的目的。2試驗(yàn)步驟1）安瓿管準(zhǔn)備選取規(guī)格約直徑為8mm，高100mm的中性玻璃安瓿管，先用2%鹽酸浸泡8～10h，再經(jīng)自來水沖洗多次，用蒸餾水涮洗2～3次，烘干；在每管內(nèi)放入打好菌號(hào)及日期的標(biāo)簽，字面朝向管壁，管口塞好棉塞，滅菌備用。在凍干后應(yīng)立即在真空下融封，才有利于長(zhǎng)期保存

6、。⑤溫度的影響在干燥和真空狀況下溫度的影響遠(yuǎn)沒有上述幾項(xiàng)因素重要，因此可以在室溫下保存，但許多微生物在4℃保存的存活率要比在室溫下高1倍。⑥含水量的影響：水分含量過高對(duì)菌存活不利，完全脫水也不利于保存，一般把干燥后的細(xì)胞含水量控制在3%以下(1%～3%)。⑦復(fù)蘇培養(yǎng)：打開安瓿管后加入無菌水使凍干菌融化，融化速度慢比快速融化的成活率要高。菌種能否適宜于凍干保存，需經(jīng)過實(shí)驗(yàn)來證明，一般是在保存1個(gè)月進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)，如果菌的成活率高于10

7、%，即認(rèn)為可用凍干保存法保存，以后6個(gè)月、2年、5年、10年再進(jìn)行檢查存活情況，以確定保存期的上限。凍干保藏的效果因微生物種類而異，一般是細(xì)菌＞放線菌＞真菌＞藻類，而菌絲體不宜用此法保存。3試驗(yàn)效果冷凍干燥保存的菌種存活時(shí)間長(zhǎng)、效果好，一般菌種可保存5年以上，有的可保藏15年以上不發(fā)生變異。還具有體積小、不易污染、便于運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)，是一種用得最為廣泛的菌種保藏方法。4試驗(yàn)儀器及試劑冷凍干燥備有不同型號(hào)和類型，但都由四個(gè)部分組成：干燥箱

8、、蒸汽捕集器、真空泵、冷凍系統(tǒng)。干燥箱可控制溫度范圍為40～40℃。四、液氮超低溫保存四、液氮超低溫保存1試驗(yàn)原理本方法是近年推廣使用的一種菌種保存法。大多數(shù)微生物如病毒、噬菌體，立克氏體，各種細(xì)菌、放細(xì)菌、支原體，各種絲狀菌、酵母、藻類和原蟲，特別是一些無法用凍干保存的微生物，都可用此法長(zhǎng)期保存。工業(yè)微生物高產(chǎn)菌種也逐步采用此法保存。液氮保存的原理是微生物在130℃以下溫度時(shí)，它的新陳代謝作用停止，化學(xué)反應(yīng)也消失，而液氮溫度可達(dá)

9、196℃，在這種情況下可以長(zhǎng)期保存。2試驗(yàn)步驟1)安瓿管準(zhǔn)備一般要求用95%料或GG17的玻管制作，以能承受巨大的溫差變化而不破損，大小根據(jù)需要而定。用印同在管壁上書寫菌號(hào)，160℃烘干，加棉塞滅菌備用。2)菌種準(zhǔn)備在最適培養(yǎng)基斜面上培養(yǎng)得到健壯菌種，制成懸浮液，如為不產(chǎn)孢子的真菌，則采用斜面或液體振蕩培養(yǎng)，制成菌絲片段。將菌懸淮分裝至滅菌安瓿管中，每管0.2～0.5ml，然后用火焰將安瓿熔封。3)凍結(jié)將熔封后的安瓿管入大慢速凍結(jié)器