腺病毒載體操作介紹及其說明介紹說明中文版解析

1、#腺病毒載體操作手冊中文版腺病毒載體操作手冊中文版AdEasyTM操作手冊目錄第一章簡介1第二章應用重組腺病毒的優(yōu)點2第三章AdEasyTM技術33.1技術概況33.2AdEasyTM系統(tǒng)中產(chǎn)生重組腺病毒的時程3第四章主要流程44.1將基因克隆入AdEasyTM轉移載體44.1.1克隆的一般原則44.1.2構建重組AdEasyTM轉移載體54.2細菌內(nèi)AdEasyTM重組子的產(chǎn)生54.2.1共轉化的一般原則54.2.2共轉化方法54.2

2、.3預期結果54.3AdEasyTM重組質粒的篩選和擴增64.4AdEasyTM重組子轉染QBI293A細胞64.4.1細胞鋪板64.4.2磷酸鈣轉化技術7第五章常用技術85.1QBI293A細胞培養(yǎng)85.1.1QBI293A細胞的初始培養(yǎng)85.1.2QBI293A細胞的維持培養(yǎng)和增殖85.1.3QBI293A細胞的凍存85.2QBI293A細胞的轉染和病毒空斑的產(chǎn)生95.2.1感染QBI293A細胞95.2.2病毒空斑形成95.2.3

3、瓊脂糖覆蓋被感染細胞95.3MOI測定105.4腺病毒感染力測定105.4.1XGal染色115.5重組腺病毒的篩選和純化115.5.1挑選最佳重組腺病毒：表達和基因輸送115.5.2病毒空斑挑選和小量擴增125.5.3Western雜交135.5.4Southern雜交和點雜交135.5.5病毒裂解產(chǎn)物PCR145.5.6免疫測定145.5.7功能測定145.6病毒顆粒在QBI293A細胞中的大量擴增155.7兩次氯化銫密度梯度離心純

4、化重組腺病毒165.7.1不連續(xù)密度梯度離心175.7.2連續(xù)密度梯度離心175.7.3病毒溶液去鹽和濃集175.8病毒滴度測定185.8.1O.D.260nm(VPml)195.8.2空斑測定法205.8.350%組織培養(yǎng)感染劑量法20第六章疑難解答226.1QBI293A細胞培養(yǎng)226.2感染力測定226.3轉移載體克隆236.4在BJ5183細胞中共轉化和重組246.5轉染QBI293A細胞256.6篩選和測定256.7在QBI2

5、93A細胞中表達266.8重組腺病毒的擴增266.9純化266.10病毒滴度測定27縮寫英文全稱中文全稱AdAdenovirus腺病毒Ad5Adenovirusserotype5血清5型腺病毒AdVAdenoviralVect腺病毒載體AmpAmpicillin氨芐青霉素βGalβGalactosidaseβ半乳糖苷酶bpBasePair堿基對BSABovineSerumAlbumin小牛血清白蛋白cDNAComplementaryDN

6、A互補DNAcccDNAClosedCircularCoiledDNA閉環(huán)螺旋DNACPECytopathicEffect細胞病理效應#腺病毒的研究人員才會采用腺病毒系統(tǒng)。昆騰生物科技公司是第一個提供完備而且能廣泛應用的重組腺病毒試劑盒AdenoQuestTM系統(tǒng)及其相關產(chǎn)品和客戶服務的公司，這個系統(tǒng)的基礎是在293細胞中產(chǎn)生重組腺病毒。現(xiàn)在介紹的AdEasyTM系統(tǒng)以細菌內(nèi)重組取代哺乳動物細胞（Heetal，1998），使獲得重組腺病

7、毒對任何有細胞培養(yǎng)設備的分子生物實驗室都更方便。重組腺病毒事實上可在任何細胞或組織中用來研究表達重組蛋白。AdEasyTM轉移載體可允許插入7.5kb的外源DNA，目前正研究腺病毒其它區(qū)的缺失以提高腺病毒在基因治療中的應用。這本手冊提供了重組腺病毒技術中所有必須遵循的原則，并詳細描述了產(chǎn)生一個重組腺病毒的所有實驗步驟，包括重組腺病毒在QBI293A細胞中擴增并純化到1012VP的操作步驟。AdEasyTM載體系統(tǒng)包含了生產(chǎn)5型重組腺病毒

8、所需的全部試劑，所有成分購買后即可使用。第二章應用重組腺病毒的優(yōu)點1.宿主范圍廣對人致病性低這套腺病毒載體系統(tǒng)可廣泛用于人類及非人類蛋白的表達。腺病毒可感染一系列哺乳動物細胞，因此在大多哺乳動物細胞和組織中均可用來表達重組蛋白。2.在增殖和非增殖細胞中感染和表達基因逆轉錄病毒只能感染增殖性細胞，因此DNA轉染不能在非增殖細胞中進行，而必須使細胞處于持續(xù)培養(yǎng)狀態(tài)。腺病毒則能感染幾乎所有的細胞類型，除了一些抗腺病毒感染的淋巴瘤細胞。腺病毒是

9、研究原代非增殖細胞基因表達的最佳系統(tǒng)，它可以使轉化細胞和原代細胞中得到的結果直接進行對比。3.能有效進行增殖，滴度高這套腺病毒系統(tǒng)可產(chǎn)生1010到1011VPml，濃縮后可達1013VPml，這一特點使它非常適用于基因治療。4.無需輔助病毒，可容納7.5kb外源DNA為提供克隆空間，此腺病毒缺失了E1和E3早期區(qū)。此外，此腺病毒可包裝比正常病毒DNA稍大的DNA分子（105%）。這些特點允許插入腺病毒的基因或多基因表達盒可達7.5kb。

10、5.與人類基因同源該腺病毒載體系統(tǒng)應用了人類病毒作為載體，以人類細胞作為宿主，因此為人類蛋白進行準確的翻譯后加工和適當?shù)恼郫B提供了一個理想的環(huán)境。大多數(shù)人類蛋白都可達到高水平表達并且具有完全的功能。6.不整合到染色體中，無插入致突變性逆轉錄病毒可隨機整合到宿主染色體，導致基因失活或激活癌基因。而腺病毒則除了卵細胞以外幾乎在所有已知細胞中都不整合到染色體中，因此不會干擾其它的宿主基因。在卵細胞中整合單拷貝病毒則是產(chǎn)生具有特定特征的轉基因動

11、物的一個較好的系統(tǒng)。7.能在懸浮培養(yǎng)液中擴增293細胞可以適應懸浮培養(yǎng)，這一調(diào)整可使病毒大量擴增。大量事實證明懸浮293細胞可在1~20L的生物反應器中表達重組蛋白。8.能同時表達多個基因這是第一個可以在同一細胞株或組織中用來設計表達多個基因的表達系統(tǒng)。最簡單的方法是將含有兩個基因的雙表達盒插入腺病毒轉移載體中，或者用不同的重組病毒共轉染目的細胞株來分別表達一個蛋白。測定不同重組病毒的MOI比值可正確估計各重組蛋白的相對共表達情況。第三