臨床醫(yī)學(xué)檢驗-臨床免疫學(xué)與檢驗

1、第四篇 臨床免疫學(xué)與檢驗,@吉普塞舞神,第一章 概述,免疫應(yīng)答的過程1、識別階段：巨噬細(xì)胞等抗原遞呈細(xì)胞對外來抗原或自身變性抗原 進行識別、攝取、降解和遞呈抗原信息給T輔助細(xì)胞 （Thc）及相關(guān)淋巴細(xì)胞的過程。2、活化階段：B細(xì)胞接受抗原刺激后活化、增殖、分化為漿細(xì)胞；

2、 T細(xì)胞在接受抗原刺激和協(xié)同刺激雙信號后活化、增殖、 分化為效應(yīng)細(xì)胞。3、效應(yīng)階段：漿細(xì)胞分泌特異性抗體，執(zhí)行體液免疫功能；T細(xì)胞中 的Th細(xì)胞分泌細(xì)胞因子等效應(yīng)分子，T殺傷細(xì)胞執(zhí)行細(xì) 胞毒效應(yīng)功能。,@吉普塞舞神,第一章 概述,免疫系統(tǒng)由免疫器官、

3、免疫細(xì)胞、免疫分子組成。（一）中樞免疫器官1、骨髓：造血干細(xì)胞（HSC）分化、發(fā)育、成熟2、胸腺：T細(xì)胞發(fā)育的重要中樞器官（二）外周免疫器官及組織1、淋巴結(jié)2、脾：最大的外周淋巴器官3、粘膜伴隨的淋巴組織：如扁桃體、小腸的派氏集合淋巴結(jié)、闌尾淋巴細(xì)胞再循環(huán)與歸巢 淋巴細(xì)胞在體內(nèi)依靠歸巢受體由定居地經(jīng)淋巴循環(huán)及血液循環(huán)不斷往返于外周免疫器官、二級淋巴組織及全身器官組織、淋巴循環(huán)匯集于胸導(dǎo)管，經(jīng)上腔靜脈

4、進入血液循環(huán)。 血液循環(huán)中的淋巴細(xì)胞及各類免疫細(xì)胞在毛細(xì)血管后微靜脈處穿越高壁內(nèi)皮細(xì)胞，進入淋巴組織及淋巴器官，再次進入淋巴循環(huán)。,@吉普塞舞神,第一章 概述,免疫細(xì)胞（一）淋巴細(xì)胞1、T細(xì)胞：胸腺依賴淋巴細(xì)胞；約占淋巴細(xì)胞的70%~75%。 ①T細(xì)胞受體（TCR）：又稱T細(xì)胞抗原受體，是T細(xì)胞特有的表面標(biāo)志。T細(xì)胞識別抗原和轉(zhuǎn)導(dǎo)信號是由TCR特異識別MHC分子遞呈的抗原肽，CD3分子轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞活化的

5、第一信號。 ②簇分化抗原（CD）：T細(xì)胞發(fā)育不同階段的亞群存在不同的分化抗原，這是區(qū)分T淋巴細(xì)胞的重要標(biāo)志。2、B細(xì)胞：骨髓依賴性淋巴細(xì)胞，約占淋巴細(xì)胞的5%~25%。主要功能：產(chǎn)生抗體、遞呈抗原、分泌細(xì)胞因子參與免疫調(diào)節(jié)。B細(xì)胞受抗原刺激后可分化為產(chǎn)生抗體的漿細(xì)胞和長壽記憶細(xì)胞。3、自然殺傷細(xì)胞（NK） NK細(xì)胞無需抗原刺激，可非特異直接殺傷腫瘤和病毒感染的細(xì)胞，因此在免疫監(jiān)視和早期抗感染免疫過

6、程中起重要作用?；罨疦K細(xì)胞可分泌IFNγ和TNFα等細(xì)胞因子，參與免疫調(diào)節(jié)作用。,@吉普塞舞神,第一章 概述,免疫細(xì)胞（二）免疫輔助細(xì)胞1、單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)共同特點是表達MHCⅡ類分子及具有吞噬作用。2、樹突狀細(xì)胞專職抗原遞呈細(xì)胞,@吉普塞舞神,第一章 概述,免疫分子（一）免疫球蛋白分泌型（sIg）：主要存在于體液中，具有抗體的各種功能。膜型（mIg）：表達于B細(xì)胞表面，稱為膜表面免疫球蛋白，為抗原

7、 受體。化學(xué)結(jié)構(gòu)：2條重鏈（H）和2條輕鏈（L）以二硫鍵連接在一起。 V-可變區(qū)；C-恒定區(qū)按照體內(nèi)含量的多少分為：IgG、IgA、IgM、IgD、IgEIg的輕鏈分為κ鏈和λ鏈，一個天然Ig分子的兩條輕鏈相同。,@吉普塞舞神,第一章 概述,免疫分子（一）免疫球蛋白1、IgG：血清中含量最高的免疫球蛋白，是再次應(yīng)答的主要抗體，

8、 也是唯一能通過胎盤的抗體。大多數(shù)抗菌抗體、抗病毒抗 體都是IgG，某些自身抗體及超敏Ⅱ型抗體也是IgG，免疫 檢測中第二抗體也以IgG為主。2、IgA：大部分血清型Ig為單體；分泌型sIgA為二聚體。每一個sIgA 分子含一個J鏈和一個分泌片。sIgA性能穩(wěn)定，主要存在于

9、胃腸道、支氣管分泌液、初乳、唾液、淚液中，是參與黏 膜局部免疫的主要抗體。3、IgM：五聚體，Ig分子中最大的，主要存在于血液。是個體發(fā)育 最早合成的抗體，也是抗原刺激后最先產(chǎn)生的抗體。感 染過程中IgM水平升高，說明近期感染；新生兒臍血中若 IgM增高，說明有宮內(nèi)感染。4、IgD：作用不明，

10、B細(xì)胞膜上的IgD可作為B細(xì)胞分化成熟的標(biāo)志。5、IgE：單體結(jié)構(gòu)，血清中最少。親細(xì)胞抗體，介導(dǎo)Ⅰ型超敏反應(yīng)， 在特異性過敏反應(yīng)和寄生蟲早期感染患者血清中可升高。,@吉普塞舞神,第一章 概述,免疫分子（二）補體系統(tǒng) 補體是存在于人和脊椎動物正常新鮮血清及組織液中的一組具有酶樣活性的球蛋白。補體的大多數(shù)組分都是糖蛋白，多屬于β球蛋白。含量最高的補體：C3、C4含量最低的補體：

11、C2 補體性質(zhì)不穩(wěn)定，加熱56℃、30min可使血清中絕大部分補體組分喪失活性，稱為滅活。補體的激活途徑：1、經(jīng)典途徑：以結(jié)合抗原后的IgG或IgM類抗體為主要激活劑，補體 C1~C9共11種成分全部參與了激活途徑。2、替代途徑：又稱旁路途徑。病原微生物等細(xì)胞壁成分提供接觸面 直接激活補體C3，然后

12、完成C5~C9的激活過程。激活 物主要是細(xì)胞壁成分。3、MBL途徑：由急性炎癥期產(chǎn)生的甘露糖結(jié)合凝集素（MBL）與病 原體結(jié)合后啟動激活。補體既可參與機體的防御效應(yīng)和自身穩(wěn)定，亦可引起免疫損傷。,@吉普塞舞神,第一章 概述,免疫分子（三）細(xì)胞因子免疫細(xì)胞分泌的多肽或小分子蛋白質(zhì)。通過自分泌、旁分泌、內(nèi)分泌的方式發(fā)

13、揮作用。按生物學(xué)功能分：白細(xì)胞介素、干擾素、生長因子、趨化因子家族、 腫瘤壞死因子、集落刺激因子。細(xì)胞因子受體分：免疫球蛋白基因超家族、I型細(xì)胞因子受體家族、 Ⅱ型細(xì)胞因子受體家族、Ⅲ型細(xì)胞因子受體家族、 趨化性細(xì)胞因子受體家族。

14、（四）黏附分子 黏附分子（CAM）是介導(dǎo)細(xì)胞間或細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間相互結(jié)合和黏附作用的小分子多肽或糖蛋白。以受體-配體的結(jié)合形式發(fā)揮作用。參與機體免疫應(yīng)答、炎癥發(fā)生、凝血、創(chuàng)傷愈合和腫瘤轉(zhuǎn)移等病理生理過程。（五）CD抗原 人類白細(xì)胞分化抗原（HLA）是指血細(xì)胞在分化成熟及活化過程中，出現(xiàn)或消失的細(xì)胞表面標(biāo)記分子。,@吉普塞舞神,第二章 抗原抗體反應(yīng),一、抗原抗體反應(yīng)的原理抗原抗體是一種非共價結(jié)

15、合、不形成共價鍵。1、靜電引力；2、范德華力；3、氫鍵結(jié)合力；4、疏水作用力：是這些結(jié)合力中最強的。親和性：是指抗體分子上一個抗原結(jié)合點與對應(yīng)的抗原表位之間相 適應(yīng)而存在的引力，它是抗原抗體間固有的引力。親和性用平衡常數(shù)K來表示，K值越大，親和性越強，結(jié)合越牢固?？贵w是球蛋白，溶解在水中為膠體溶液，不會發(fā)生自然沉淀。,@吉普塞舞神,第二章 抗原抗體反應(yīng),二、抗原抗體反應(yīng)的特點1、特異性

16、；2、可逆性：親和層析法就是利用這個原理來純化抗原或抗體。3、比例性：只有當(dāng)抗原抗體分子比例合適時充分結(jié)合，沉淀物形 成快而多，稱為抗原抗體反應(yīng)的等價帶； 若抗原或抗體極度過剩則無沉淀形成，稱為帶現(xiàn)象， 抗體過量時，稱為前帶，抗原過量時，稱為后帶。4、階段性：第一階段為抗原抗體發(fā)生特異性結(jié)

17、合的階段，反應(yīng)快； 第二階段為可見反應(yīng)階段，反應(yīng)慢。,@吉普塞舞神,第二章 抗原抗體反應(yīng),三、影響抗原抗體反應(yīng)的因素 抗體的濃度、特異性和親和性都影響抗原抗體的反應(yīng)。等價帶的寬窄也影響抗原抗體復(fù)合物的形成，單克隆抗體不適于沉淀反應(yīng)。顆粒性抗原出現(xiàn)凝集反應(yīng)；可溶性抗原出現(xiàn)沉淀反應(yīng)；單價抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合不出現(xiàn)沉淀反應(yīng)。環(huán)境因素1、電解質(zhì)：抗原

18、抗體發(fā)生特異性結(jié)合后，由親水膠體變?yōu)槭杷z體， 此過程需要電解質(zhì)參加，常用0.85%NaCl。2、酸堿度：一般在pH 6~9之間。3、溫度：一般以15℃~40℃為宜。,@吉普塞舞神,第三章 免疫原和抗血清的制備,免疫原：指能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細(xì)胞，并能在體內(nèi)外與 抗體或致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異性反應(yīng)的物質(zhì)。一、顆粒型抗原的制備各種細(xì)胞、細(xì)菌

19、、寄生蟲等皆為顆粒型抗原1、細(xì)胞抗原（如綿陽紅細(xì)胞）一般情況下經(jīng)生理鹽水或其他溶液洗凈，配置一定濃度即可。2、細(xì)菌抗原多用液體或固體培養(yǎng)基，經(jīng)集菌后處理。顆粒性抗原大多用靜脈內(nèi)注射免疫法。二、可溶性抗原的制備與純化蛋白質(zhì)、糖蛋白、脂蛋白、酶、補體、細(xì)菌毒素、免疫球蛋白片段、核酸等。胃蛋白酶或胰酶處理，可獲得游離的單個細(xì)胞。溶菌酶、蝸牛酶、纖維素酶等使細(xì)菌或組織裂解。木瓜酶將IgG裂解成2個Fab片段和1個Fc片段；胃

20、蛋白酶可將IgG裂解成F（ab，）2片段及數(shù)個小片段；胰蛋白酶可將IgG切成不規(guī)則的肽鏈。,@吉普塞舞神,第三章 免疫原和抗血清的制備,三、半抗原性免疫原的制備半抗原：某物質(zhì)在獨立存在時只具有抗原性而無免疫原性。半抗原與蛋白質(zhì)載體或高分子聚合物結(jié)合后才有免疫原性。載體1、蛋白質(zhì)類：以牛血白蛋白最常用。2、多肽聚合物：常用多聚賴氨酸。3、大分子聚合物和某些顆粒。半抗原性免疫原的鑒定一般認(rèn)為至少要20個以上的半抗原分

21、子連接到一個載體分子上，才能有效刺激免疫動物產(chǎn)生抗體。因此，在半抗原與載體連接后，應(yīng)測定半抗原與載體的比例。1、吸收光譜分析法2、放射性核素標(biāo)記半抗原滲入法,@吉普塞舞神,第三章 免疫原和抗血清的制備,免疫佐劑佐劑的種類1、化合物，如弗氏不完全佐劑2、生物制劑，①經(jīng)處理改造的細(xì)菌及代謝產(chǎn)物，如卡介苗； ②細(xì)胞因子及熱休克蛋白等。弗氏佐劑分為弗氏完全佐劑和弗氏不完全

22、佐劑弗氏完全佐劑=弗氏不完全佐劑+卡介苗使用時加入水溶性抗原并充分乳化，使抗原與佐劑形成油包水乳劑。佐劑和抗原的比例為1:1。佐劑的作用1、改變抗原的物理性狀、延緩抗原降解和排除，從而更有效地刺激免疫系統(tǒng)；2、刺激單核-吞噬細(xì)胞系統(tǒng)，增強其處理和遞呈抗原的能力；3、刺激淋巴細(xì)胞增殖和分化；4、致變抗體的產(chǎn)生類型和誘導(dǎo)遲發(fā)型超敏反應(yīng)。,@吉普塞舞神,第三章 免疫原和抗血清的制備,抗血清的制備含有抗體的血清即抗血清。

23、抗原來源與動物種屬差異越大，免疫原性越強，免疫效果越好。R型抗血清：用家兔及其他動物免疫產(chǎn)生的抗體，抗原抗體反應(yīng)比 例合適范圍較寬，適于作為診斷試劑。H型抗血清：用馬等大型動物免疫產(chǎn)生的抗體，抗原抗體反應(yīng)比例 合適范圍較窄，一般作為免疫治療。某些動物體內(nèi)有類似物質(zhì)時，蛋白質(zhì)抗原對這些動物免疫原性極差。如：IgE對綿羊；胰島素對家兔；

24、多種酶類對山羊。,@吉普塞舞神,免疫程序1、免疫原的劑量： 劑量過大或過小都有可能產(chǎn)生免疫耐受，在一定劑量范圍內(nèi)，免疫原劑量越大，產(chǎn)生的抗體效價越高。2、免疫途徑： 皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、靜脈、腹腔、淋巴結(jié)等途徑。皮內(nèi)或皮下免疫時一般采用多點注射。初次免疫一般選擇皮內(nèi)接種，加強免疫和顆粒性抗原一般選擇靜脈注射。寶貴抗原可選擇淋巴結(jié)內(nèi)微量注射。3、免疫間隔時間 第1次與第2次免疫間隔

25、時間以10~20天為好，第3次及以后的間隔一般為7~10天。采血法1、頸動脈采血法2、心臟采血法3、靜脈采血法,第三章 免疫原和抗血清的制備,@吉普塞舞神,第三章 免疫原和抗血清的制備,抗血清的鑒定1、抗體特異性的鑒定常用雙向免疫擴散法，觀察沉淀線。2、抗體效價的測定顆粒型抗原-凝集試驗可溶性抗原-雙向免疫擴散試驗、ELISA等稀釋方法：①將經(jīng)過系列稀釋的血清分別與一個濃度的抗原反應(yīng)；②同時稀釋抗原和抗血清，分

26、別與不同濃度的抗血清進行雙向免 疫擴散實驗（棋盤滴定）3、抗體純度的鑒定SDS-PAGE、雙向免疫擴散試驗、免疫電泳等抗血清的保存①短期保存：2~8℃；②冷凍：-80~-20℃，分為小包裝，一般保存5年，避免反復(fù)凍融。③真空干燥：5~10年,@吉普塞舞神,第三章 免疫原和抗血清的制備,抗血清的純化IgG類抗體的純化方法有鹽析法、凝膠過濾法、離子交換層析法、親和層析法。雜質(zhì)的去除：1、親和層析法

27、 2、吸附劑法,@吉普塞舞神,第四章 單克隆抗體與基因工程抗體的制備,雜交瘤技術(shù)：利用聚乙二醇（PEG）為細(xì)胞融合劑，使免疫的小鼠脾細(xì)胞與具有體外生長繁殖能力的小鼠骨髓瘤細(xì)胞融為一體。這種雜交瘤細(xì)胞擴大培養(yǎng)，接種于小鼠腹腔積液中即可得到高效價的單克隆抗體。小鼠骨髓瘤細(xì)胞：次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶（HGPRT）或胸腺 嘧啶

28、激酶（TK）的缺陷株腫瘤細(xì)胞合成DNA一般有兩條途徑：一條是生物合成的主要途徑，利用糖和氨基酸合成核苷酸進而合成DNA，葉酸拮抗物（甲氨蝶呤）可阻斷該途徑；另一條是替代途徑，當(dāng)葉酸代謝受阻時，細(xì)胞通過HGPRT和TK利用核苷酸的前體合成核苷酸，進而合成DNA。因此篩選雜交瘤細(xì)胞用HAT培養(yǎng)液。HAT培養(yǎng)液：在基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)添加次黃嘌呤、甲氨蝶呤和胸腺嘧啶核苷。細(xì)胞的選擇：有限稀釋法、顯微操作法、熒光激活細(xì)胞分選儀、軟瓊脂平板

29、法。,@吉普塞舞神,第四章 單克隆抗體與基因工程抗體的制備,單克隆抗體的特性：1、高度特異性2、高度的均一性和可重復(fù)性3、弱凝集反應(yīng)和不呈現(xiàn)沉淀反應(yīng)4、對環(huán)境敏感性局限性：單克隆抗體反應(yīng)強度不如多克隆抗體基因工程抗體1、人源化抗體：減少抗體異源性，利于臨床應(yīng)用。嵌合抗體：從雜交瘤細(xì)胞里分離出可變區(qū)基因，與人Ig恒定區(qū)的基 因連接，表達鼠-人嵌合抗體。改型抗體：將人抗體可變區(qū)

30、（V）中互補決定簇（CDR）序列改成鼠 源單抗CDR序列。2、小分子抗體：可在大腸桿菌等原核細(xì)胞內(nèi)表達。3、抗體融合蛋白：指利用基因工程技術(shù)將抗體片段與其他生物活 性蛋白融合得到的產(chǎn)物。4、雙特異性抗體：兩個抗原結(jié)合位點具有不同的特異性。5、噬菌體抗體庫技術(shù)：可以得到完全人源性的抗體，在HIV等病毒

31、 感染和腫瘤的診斷與治療方面有其獨特的優(yōu)越性。,@吉普塞舞神,第五章 凝集反應(yīng),凝集反應(yīng)是一個定性或半定量的檢測方法，將抗體做一系列稀釋，與抗原結(jié)合產(chǎn)生凝集的最高稀釋倍數(shù)作為其效價或滴度。兩個階段：①抗原抗體特異性結(jié)合；②出現(xiàn)可見的顆粒聚集。直接凝集反應(yīng)原理：細(xì)菌、螺旋體和紅細(xì)胞等顆粒性抗原，在適當(dāng)?shù)碾娊赓|(zhì)參與下可直接與相應(yīng)抗體結(jié)合出現(xiàn)凝集。抗原—凝集原

32、抗體—凝集素1、玻片凝集試驗：定性分析，一般用來鑒定菌種和ABO血型測定。2、試管凝集試驗：半定量，用定量抗原懸液與一系列梯度倍比稀釋的待檢血清混合，保溫靜置后，根據(jù)每管內(nèi)顆粒凝集的程度，判斷待檢血清中有無相應(yīng)抗體及效價。如肥達試驗—診斷傷寒、副傷寒； 外斐試驗—診斷立克次體； 輸血時的交叉配血試驗。,@吉普塞舞神,第五章 凝集反應(yīng),間接凝集反應(yīng) 是將可溶性抗原（或抗體）先吸附于適當(dāng)大小的顆粒性載

33、體表面，然后與相應(yīng)抗體（或抗原）作用，在適宜電解質(zhì)存在的條件下，出現(xiàn)特異性凝集現(xiàn)象。間接凝集反應(yīng)的類型1、正向間接凝集反應(yīng)：可溶性抗原致敏載體，用以檢測標(biāo)本中待測抗體的凝集反應(yīng)。2、反向間接凝集反應(yīng)：特異性抗體致敏載體，用以檢測標(biāo)本中待測抗原的凝集反應(yīng)。3、間接凝集抑制試驗：先將可溶性抗原（或抗體）與相應(yīng)抗體（或抗原）試劑混合，然后再加入抗原（抗體）致敏的載體顆粒，則能抑制原先的凝集現(xiàn)象，稱為正向（或反向）間接凝集抑制試

34、驗。4、協(xié)同凝集反應(yīng)：用金黃色葡萄球菌A蛋白（SPA）做載體，它能夠與IgG的Fc段結(jié)合，稱為抗體致敏的顆粒載體。如與相應(yīng)抗原接觸，即出現(xiàn)反向間接血凝抑制試驗?？捎糜诩?xì)菌、病毒的直接檢測。間接血凝抑制試驗載體常用紅細(xì)胞、膠乳顆粒及明膠顆粒,@吉普塞舞神,第五章 凝集反應(yīng),明膠凝集試驗：血清中含有病毒抗體則呈肉眼可見的粉紅色凝集。廣泛用于HIV-1抗體和抗精子抗體等的檢測。自身紅細(xì)胞凝集試驗 抗人O型紅細(xì)胞的單

35、克隆抗體能與任何型紅細(xì)胞結(jié)合，但不引起凝集反應(yīng)，這種抗體與另一特異性抗體連接成的雙功能抗體，可用于檢測標(biāo)本中的抗原。反應(yīng)中的紅細(xì)胞是未經(jīng)致敏的受檢者新鮮紅細(xì)胞，因此反應(yīng)中的標(biāo)本為受檢者的全血?？捎糜贖IV抗體，HBsAg的檢測?？骨虻鞍自囼炗址QCoombs試驗，是檢測抗紅細(xì)胞不完全抗體的一種有效方法。包括直接C試驗和間接C試驗，分別檢測紅細(xì)胞上的不完全抗體和游離在血清中的不完全抗體。廣泛應(yīng)用于血液病的檢測，如自身免疫性溶血性貧

36、血、藥物誘導(dǎo)的貧血、新生兒溶血癥等，還可采用專一特異性的抗球蛋白的血清，如抗IgG血清、抗IgA或抗IgM以及抗補體血清等，分析結(jié)合于紅細(xì)胞上的不完全抗體的免疫球蛋白亞類。,@吉普塞舞神,第六章 沉淀反應(yīng),沉淀反應(yīng)：指可溶性抗原與相應(yīng)抗體在特定條件下發(fā)生特異性結(jié)合時 出現(xiàn)的沉淀現(xiàn)象。沉淀反應(yīng)的抗原多為蛋白質(zhì)、多糖、血清、毒素等可溶性物質(zhì)。第一階段：抗原抗體發(fā)生特異性結(jié)合，肉眼不可見，時間

37、短。第二階段：形成可見的免疫復(fù)合物，如沉淀線、沉淀環(huán)， 約需幾十分鐘到數(shù)小時。,@吉普塞舞神,液體內(nèi)沉淀實驗 抗原抗體溶液在電解質(zhì)的存在下結(jié)合，形成絮狀沉淀物，這種絮狀沉淀受抗原抗體比例的直接影響，因此常用來作為測定抗原抗體反應(yīng)最適比例的方法。1、抗原稀釋法；2、抗體稀釋法；3、方陣滴定法（棋盤滴定法）。免疫濁度測定本質(zhì)上屬于液體內(nèi)沉淀反應(yīng)，可進行液體中微量抗原、抗

38、體及小分子半抗原定量檢測。抗原過量：形成IC（免疫復(fù)合物）分子小，且會發(fā)生再解離，濁 度下降，這叫做高劑量鉤狀效應(yīng)?？贵w過量：IC的形成隨著抗原的增加而增加，抗原抗體最適比例 處達到高峰，這就是經(jīng)典的海德堡曲線理論。免疫比濁法的基本原理就是在反應(yīng)體系中保持抗體適當(dāng)過量?？贵w的選擇：特異性強、效價高、親和力強，使用R型抗體。pH6.5~8.

39、5 使用磷酸鹽緩沖液做反應(yīng)液增濁劑：聚乙二醇（PEG）、吐溫-20,第六章 沉淀反應(yīng),@吉普塞舞神,凝膠內(nèi)沉淀試驗 利用可溶性抗原和相應(yīng)抗體在凝膠內(nèi)擴散，形成濃度梯度，在抗原抗體濃度比例恰當(dāng)?shù)奈恢眯纬扇庋劭梢姷某恋砭€或沉淀環(huán)。凝膠支持物：瓊脂、瓊脂糖、葡聚糖、聚丙烯酰胺凝膠等。1、單向擴散試驗 在瓊脂內(nèi)混入抗體，待測抗原從局部向瓊脂內(nèi)自由擴散，如抗原和相應(yīng)抗體結(jié)合，形成沉淀環(huán)。Man

40、cini曲線（M曲線）：適用大分子抗原和長時間擴散（＞48h）結(jié) 果，沉淀環(huán)直徑的平方與抗原濃度呈線性關(guān)系。Fahey（F曲線）：適用于小分子抗原和較短時間（24h）擴散的結(jié)果， 用半對數(shù)紙畫線，濃度對數(shù)與擴散環(huán)直徑呈線性關(guān)系。雙環(huán)現(xiàn)象：出現(xiàn)兩種抗原性相同成分。,第六章 沉淀反應(yīng),@吉普塞舞神

41、,凝膠內(nèi)沉淀試驗2、雙向擴散試驗 讓抗原和抗體雙方都在瓊脂中各自向?qū)Ψ綌U散，在比例恰當(dāng)處形成抗原抗體沉淀線，觀察這種沉淀線的位置、形狀以及對比關(guān)系，可對抗原或抗體進行定性分析。平板法是最常用的方法。①抗原或抗體的存在與否以及相對含量的估計：②抗原抗體相對分子量的估計：擴散慢者圈子小，局部濃度大，形成的沉淀線彎向分子量大的一方，如果分子量大致相等，則呈直線。③抗原性質(zhì)的分析：兩條沉淀線相互吻合，說明抗體和兩個抗

42、原的相同表位結(jié)合而沉淀，兩個抗原相同；沉淀線呈部分相切，說明兩個抗原之間有部分相同；兩條沉淀線交叉而過，說明兩個抗原完全不同。④抗體效價的滴定：出現(xiàn)沉淀線最高的抗體稀釋度為該抗體效價。⑤抗原或抗體純度鑒定：多條沉淀線說明抗體不純。,第六章 沉淀反應(yīng),@吉普塞舞神,免疫電泳技術(shù)1、對流免疫電泳實質(zhì)是將雙向免疫擴散與電泳相結(jié)合的定向加速的免疫擴散技術(shù)。抗原帶負(fù)電荷向正極移動；抗體在電滲作用下隨水流向負(fù)極。2、火箭免疫電泳實質(zhì)

43、是加速的單向擴散試驗。3、免疫電泳是區(qū)帶電泳與免疫雙擴散相結(jié)合的免疫分析技術(shù)。 抗原經(jīng)電泳分區(qū)帶，沿電泳方向挖一平行抗體槽，加入相應(yīng)抗血清做雙向擴散，形成弧形沉淀線。 多發(fā)性骨髓瘤患者血清在免疫電泳后，可觀察到異常的M蛋白沉淀弧。4、免疫固定電泳電泳加沉淀反應(yīng)技術(shù)，可用于各種蛋白質(zhì)鑒定。 先將待測樣品做區(qū)帶電泳，覆蓋抗血清，形成抗原抗體復(fù)合物而沉淀。分辨率強，敏感性高，操作周

44、期短，結(jié)果易于分析，目前作為常規(guī)檢測。5、交叉免疫電泳將區(qū)帶電泳和火箭免疫電泳相結(jié)合，可一次同時對多種抗原定量。,第六章 沉淀反應(yīng),@吉普塞舞神,第七章 放射免疫分析,放射免疫分析（RIA） 是以放射性核素標(biāo)記的抗原與反應(yīng)系統(tǒng)中未標(biāo)記抗原競爭結(jié)合特異性抗體為基本原理來測定待檢樣品中抗原量的一種分析方法。免疫放射分析（IRMA） 是用放射性核素標(biāo)記的過量抗體與待測抗原直接結(jié)合，采用固相免疫吸附載

45、體分離結(jié)合與游離標(biāo)記抗體的非競爭放射免疫分析法。常用的放射性核素：125I、131I、3H、14C 放射性碘原子通過取代反應(yīng)置換被標(biāo)記物分子中酪氨酸或酪胺殘基及組胺殘基上的氫原子。比較：IRMA反應(yīng)速率、特異性、靈敏度和檢測范圍都較RIA高。應(yīng)用：常用于各種激素、微量蛋白質(zhì)、腫瘤標(biāo)志物和藥物等測定。,@吉普塞舞神,第八章 熒光免疫技術(shù),常用熒光色素：1、異硫氰酸熒光素（FITC）：黃綠色熒光，最常用；2

46、、四乙基羅丹明（RB200）：橘紅色熒光；3、四甲基異硫氰酸羅丹明（TRITC）：橙紅色熒光；4、藻紅蛋白（R-RE）：橙色熒光。其他熒光物質(zhì)：某些3價稀土鑭系元素，其中銪（Eu3+）應(yīng)用最廣，其熒光衰變時間長，最適合用于時間分辨熒光免疫測定。時間分辨熒光免疫測定（TRFIA）：是一種非放射性核素免疫分析技術(shù)，用鑭系元素標(biāo)記抗原或抗體，根據(jù)鑭系元素螯合物的發(fā)光特點，用時間分辨技術(shù)測量熒光，同時檢測波長和時間兩個參數(shù)進行信號分辨

47、，可有效排除非特異性熒光的干擾，極大提高了分析靈敏度。熒光偏振免疫測定：利用抗原抗體競爭反應(yīng)原理，根據(jù)熒光素標(biāo)記抗原與其抗原抗體復(fù)合物的熒光偏振程度的差異，測定體液中小分子物質(zhì)的含量。常用FITC標(biāo)記小分子抗原。,@吉普塞舞神,第八章 熒光免疫技術(shù),熒光酶免疫測定：利用酶標(biāo)記抗原或抗體，與待檢物反應(yīng)，借助酶反應(yīng)熒光底物，經(jīng)酶促反應(yīng)生成穩(wěn)定且高效的熒光物質(zhì)，通過測定熒光強度確定待檢抗原或抗體的含量。常用堿性磷酸酶ALP標(biāo)記。熒光免

48、疫技術(shù)的應(yīng)用1、自身抗體檢測；2、病原體檢測；3、免疫病理檢測；4、細(xì)胞表面抗原和受體檢測。,@吉普塞舞神,第九章 酶免疫技術(shù),酶免疫技術(shù)：在酶標(biāo)抗體（抗原）與抗原（抗體）的特異性反應(yīng)完成后，加入酶的相應(yīng)底物，通過酶對底物的顯色反應(yīng)，對抗原或抗體進行定位、定性或定量的測定分析。常用酶及其底物1、辣根過氧化物酶（HRP）：由無色的糖蛋白（主酶）和亞鐵血紅素（輔基）結(jié)合而成的復(fù)合物。輔基是酶活性基團。底物：鄰苯二胺（OPD）

49、、四甲基聯(lián)苯胺（TMB）應(yīng)用廣泛2、堿性磷酸酶（AP）底物：對硝基苯磷脂酸（p-NPP）3、β-半乳糖苷酶（β-Gal）：因人血中缺乏此酶，以其制備的酶標(biāo)志物在測定時不易受到內(nèi)源性酶的干擾，從而提高特異性，被用于均相酶免疫測定中。底物：4-MUU,@吉普塞舞神,第九章 酶免疫技術(shù),酶免疫技術(shù)：1、酶免疫測定（EIA）：用于液體標(biāo)本中抗原或抗體的定性和定量。2、酶免疫組織化學(xué)技術(shù)：用于組織切片或其他標(biāo)本中抗原的定位。均相酶

50、免疫測定 利用酶標(biāo)志物與相應(yīng)的抗原或抗體結(jié)合后，標(biāo)記酶的活性會發(fā)生改變的原理，可以在不將結(jié)合和游離酶標(biāo)志物分離的情況下，通過測定標(biāo)記酶的活性的改變而確定抗原或抗體的含量。異象酶免疫測定是目前應(yīng)用最廣泛的一類，分為液相和固相酶免疫測定兩類。如ELISA。,@吉普塞舞神,第九章 酶免疫技術(shù),ELISA三個必要的試劑：①固相的抗原或抗體；②酶標(biāo)記的抗原或抗體；

51、 ③酶反應(yīng)的底物。抗原測定：①雙抗體夾心法：常用。②雙位點一步法：針對抗原上的兩個不同的抗原決定簇的兩種抗體，一個用來包被，一個用來酶標(biāo)記。當(dāng)抗原過量時可分別結(jié)合固相抗體和酶標(biāo)記抗體，出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)。③競爭法：針對只有單個抗原決定簇的小分子?？贵w測定：①間接法：固相抗原-待測抗體-酶標(biāo)抗抗體復(fù)合物。②雙抗原夾心法③競爭法：多用于乙型肝炎病毒核心抗體（HBcAb）和乙型肝炎病毒e抗體（HBeAb）的檢測。④捕

52、獲法：又稱反向間接法，常用病原體急性感染診斷中的IgM抗體。應(yīng)用：ELISA可用于病毒（甲肝、乙肝兩對半等）風(fēng)疹、皰疹、輪狀病毒等；細(xì)菌如結(jié)核、HP等，也用于各種免疫球蛋白、補體、腫瘤標(biāo)志物等。,@吉普塞舞神,第十章 化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù),直接化學(xué)發(fā)光劑：1、吖啶酯；2、三聯(lián)吡啶釕酶促反應(yīng)發(fā)光劑：標(biāo)記酶有HRP和堿性磷酸酶； HRP催化的發(fā)光劑為魯米諾及其衍生物

53、； AP催化的發(fā)光底物為AMPPO。,@吉普塞舞神,第十一章 生物素-親和素放大技術(shù),生物素（biotin，B）、親和素（avidin，A）生物素-親和素系統(tǒng)（BAS）是一種以生物素和親和素具有的多級放大結(jié)合特性為基礎(chǔ)的實驗技術(shù)，既能偶聯(lián)抗原抗體等大分子生物活性物質(zhì)，又可被熒光素、酶、放射性核素等材料標(biāo)記。生物素：可以標(biāo)記蛋白質(zhì)氨基、醛基、巰基和核酸。親和素（

54、AV）和鏈霉親和素（SA）是生物素的天然特異性結(jié)合物。1個AV和SA能結(jié)合4個生物素分子，因此具有放大效應(yīng)。,@吉普塞舞神,第十一章 生物素-親和素放大技術(shù),BAS的應(yīng)用1、BAB法：也稱僑聯(lián)親和素-標(biāo)記生物素法（BRAB），以游離的親和素 作為僑聯(lián)劑，利用親和素的多價性，將檢測體系中的抗原-生 物素化抗體復(fù)合物與標(biāo)記生物素連接起來。

55、 抗原-生物素+親和素+生物素-標(biāo)記2、ABC法：預(yù)先按一定比例將親和素與酶標(biāo)生物素結(jié)合，當(dāng)其與反應(yīng)體 系中的生物素化抗體相遇時，ABC中未飽和的親和素結(jié)合部位 即可與抗體上的生物素結(jié)合。 抗體-生物素+親和素-生物素-酶標(biāo)復(fù)合物3、BA法：也叫LAB法，以標(biāo)記親和素直接與免疫

56、復(fù)合物中的生物素化抗 體連接進行檢測。 酶標(biāo)記-親和素+生物素-抗體BAS用于熒光抗體技術(shù)，通常用BA法，用熒光素直接標(biāo)記親和素。,@吉普塞舞神,第十二章 固相膜免疫測定,以微孔膜作為固相，固相膜的特點：多孔性、高度吸附抗體或抗原、易于漂洗，可被液體穿過流出，液體也可通過毛細(xì)管作用在膜上向前移行。標(biāo)記物可用酶、彩色乳膠、膠體金、膠體硒等。常用固相

57、膜：玻璃纖維素膜、尼龍膜、聚偏氟乙烯（PVDF）膜和 硝酸纖維素（NC）膜，最長用NC膜免疫金標(biāo)記技術(shù)：標(biāo)志物在配體處大量聚集時，肉眼可見紅色或粉紅色斑點，因而用于定性或半定量的快速免疫檢測。免疫滲濾實驗（IFA）用于檢測各種傳染病的抗體和腫瘤標(biāo)志物等。用以檢測尿液HCG的“金標(biāo)”早孕診斷試劑也已廣泛使用。結(jié)果：膜中央有清晰的淡紅色或紅色斑點為陽性，反之陰性。免疫層析實驗

58、（ICA）：常用膠體金，稱為金免疫層析實驗（GICA）與IFA的不同在于液體的移動不是直向穿流，而是基于層析作用的橫流。結(jié)果：陰性為一條棕紅線條帶；陽性為兩條，無條帶為試劑失效。,@吉普塞舞神,第十二章 固相膜免疫測定,斑點酶免疫吸附實驗（Do-ELISA）：與ELISA不同之處在于載體為蛋白質(zhì)、NC膜，沒作用于底物后形成有色的沉淀物，使NC膜染色。結(jié)果：陽性者在膜上出現(xiàn)肉眼可見的染色斑點，靈敏度比ELISA高。酶聯(lián)免疫斑點實

59、驗（ELISPOT）：體外檢測特異性抗體分泌B細(xì)胞和細(xì)胞因子分泌T細(xì)胞。檢測活細(xì)胞。結(jié)果：陽性PVDF膜出現(xiàn)紫色斑點。1個斑點代表一個細(xì)胞，靈敏度高。應(yīng)用非常廣泛：如移植中排斥反應(yīng)的預(yù)測，疫苗發(fā)展、Th1/Th2分析、自身免疫性疾病研究、腫瘤研究、過敏性疾病研究、感染性疾病研究、抗原決定簇圖譜分析、化合物和藥物免疫學(xué)反應(yīng)的篩選。免疫印跡法（Western Blot）：常用多克隆抗體。,@吉普塞舞神,第十三章 免疫組織化學(xué)技術(shù),

60、標(biāo)本：1、活體組織：應(yīng)取材于病變組織及病變與正常組織交織處。2、各種體液、穿刺液：直接涂片或經(jīng)離心涂片。3、培養(yǎng)細(xì)胞：單層細(xì)胞直接固定。固定劑：10%福爾馬林制片方法1、冰凍切片：使抗原得到最大限度保存，但形態(tài)保存不佳2、石蠟切片：研究形態(tài)學(xué)的主要制片方法常用抗原暴露方法：微波法、高壓鍋法標(biāo)本的保存：最好直接鏡檢，4℃干燥可保存1個月。 但病毒和某些組織抗原標(biāo)本抗原性喪失

61、很快，需-20℃下保存。,@吉普塞舞神,第十三章 免疫組織化學(xué)技術(shù),,酶免疫組織化學(xué)技術(shù)的優(yōu)點（與熒光免疫技術(shù)相比）：可長期保存、可用普通光鏡觀察、可觀察組織細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)、敏感度高。1、直接法：將酶標(biāo)記在特異抗體上，直接與組織內(nèi)抗原反應(yīng)。2、間接法：將酶標(biāo)記在二抗上，先將一抗與相應(yīng)的組織抗原結(jié)合， 再連接二抗。應(yīng)用廣泛。免疫組化中常用的酶及顯色底物1、HRP：底物為二氨基聯(lián)

62、苯胺（DAB），反應(yīng)產(chǎn)物呈棕色。2、氨基乙基卡巴唑（AEC）：反應(yīng)產(chǎn)物呈橘紅色。3、4-氯-1-萘酚：產(chǎn)物灰藍色。廣義的親和組織化學(xué)染色包括：抗原與抗體；植物凝集素與糖類；生物素與親和素；SPA與IgG；陽離子與陰離子；配體與受體。,@吉普塞舞神,第十四章 免疫細(xì)胞的分離及其表面標(biāo)志檢測技術(shù),外周血單個核細(xì)胞的分離密度梯度離心2份6%聚蔗糖蒸餾水+1份34%泛影葡胺生理鹽水，比重為1.077±0.002；作為

63、淋巴細(xì)胞分離液，即Ficoll液。上到下依次為：稀釋的血漿層、單個核細(xì)胞層、粒細(xì)胞層和紅細(xì)胞層。淋巴細(xì)胞的分離利用單核細(xì)胞在37℃和Ca2+存在時，能主動黏附在玻璃、塑料等材料上的特性，從單個核細(xì)胞懸液中去除單核細(xì)胞，從而獲得淋巴細(xì)胞。也可用Percoll分離液法。分離細(xì)胞的保存1、短期保存：將細(xì)胞用含10%~20%滅活小牛血清的培養(yǎng)液稀釋重懸， 4℃保存。2、長

64、期保存：液氮，加DMSO?；盍y定：臺盼藍藍色，活細(xì)胞不著色，死細(xì)胞呈藍色。,@吉普塞舞神,第十四章 免疫細(xì)胞的分離及其表面標(biāo)志檢測技術(shù),淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志及亞群分類一、T細(xì)胞表面標(biāo)志及其亞群T細(xì)胞共同的標(biāo)志抗原：CD3輔助性T細(xì)胞（Th）：CD3+CD4+CD8-；細(xì)胞毒性T細(xì)胞（Tc/CTL）：CD3+CD4-CD8+；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tr/Treg）：CD4+CD25+。CD2：表達于全部人T細(xì)胞和NK細(xì)胞，因能與綿陽

65、紅細(xì)胞（SRBC） 結(jié)合，又稱綿羊紅細(xì)胞受體。CD3：表達于全部T細(xì)胞表面，是TCR-CD3復(fù)合物的重要組成部分。CD4/CD8：表達CD4的主要是輔助性T細(xì)胞、表達CD8的主要是細(xì)胞 毒性T細(xì)胞。其他表面標(biāo)志：致有絲分裂受體①輔助性T細(xì)胞分為：Th1、Th2Th1主要分泌IL-2、IFN-γ或TNF-β等細(xì)胞因子輔助細(xì)胞免疫或參與遲發(fā)型超敏反應(yīng)，本身具有明顯的

66、細(xì)胞毒作用。Th2主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10等細(xì)胞因子輔助體液免疫，參與速發(fā)型超敏反應(yīng)，但本身不具有明顯的細(xì)胞毒作用。②細(xì)胞毒性T細(xì)胞分為：Tc1、Tc2都有典型的細(xì)胞毒作用。,@吉普塞舞神,第十四章 免疫細(xì)胞的分離及其表面標(biāo)志檢測技術(shù),淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志及亞群分類二、B細(xì)胞表面標(biāo)志B細(xì)胞的重要表面標(biāo)志：膜免疫球蛋白（SmIg）、Fc受體、補體受體、EB病毒受體、小鼠紅細(xì)胞受體。SmIg為B細(xì)胞特有，是鑒

67、定B細(xì)胞的可靠指標(biāo)。SmIg又稱BCR，mIg的主要作用是結(jié)合特異性抗原，故又稱抗原受體。成熟的B細(xì)胞的mIg主要為mIgM和mIgD。B細(xì)胞的表面特異CD分子有CD19、CD20、CD21、CD22和CD23等。B細(xì)胞及其亞群的檢測是研究自身免疫性疾病及疾病中免疫調(diào)節(jié)紊亂的重要指標(biāo)。三、NK細(xì)胞表面標(biāo)志NK細(xì)胞典型標(biāo)志：CD3-CD16+CD56+CD16分子又稱為低親和性IgG Fc受體，行使針對靶細(xì)胞的定向非特異性殺

68、傷作用，也即NK細(xì)胞的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用（ADCC）。,@吉普塞舞神,第十四章 免疫細(xì)胞的分離及其表面標(biāo)志檢測技術(shù),其他免疫細(xì)胞抗原遞呈細(xì)胞（APC）①“專職”抗原遞呈細(xì)胞，包括巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和B細(xì)胞，它們均可表達MHC-Ⅱ類分子；②“非專職”抗原遞呈細(xì)胞，包括內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞和激活T細(xì)胞等。單核-吞噬細(xì)胞系統(tǒng)（MPS）典型表面標(biāo)志是CD14。DC細(xì)胞的主要特征表面標(biāo)志是CD1a、CD11c和CD83