苦參堿抑制胃癌細(xì)胞增殖機(jī)制研究.pdf

1、自上世紀(jì)七十年代以來,我國(guó)惡性腫瘤的發(fā)生率和死亡呈明顯上升趨勢(shì),成為威脅公共健康的主要問題.據(jù)2005年的統(tǒng)計(jì)資料顯示,作為一種常見消化道腫瘤,胃癌的發(fā)病率及死亡率分為54.5/10萬(wàn)、42.1/10萬(wàn),均居各類腫瘤的第三位.目前胃癌的治療以多種方式聯(lián)合的綜合治療為主,但以胃癌發(fā)病率和死亡率數(shù)值之接近來看,胃癌的治療效果不容樂觀.所以尋找新型抗腫瘤藥物成為各種基礎(chǔ)和臨床研究的重點(diǎn).傳統(tǒng)中藥有著悠久的抗腫瘤治療歷史.作為中國(guó)的特色資源,發(fā)

2、掘其抗腫瘤治療的新靶點(diǎn)有著重要的研究意義.苦參堿 (Matrine) 屬喹諾里西啶類,是中藥苦參含量最高的生物堿成分之一.眾多研究表明,苦參堿具有體內(nèi)及體外抗腫瘤作用.苦參堿可以抑制人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721、人胃腺癌細(xì)胞系MKN45、SGC7901的增殖,進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)提示苦參堿誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡與上調(diào)Bcl-2家族的促凋亡因子和上調(diào)細(xì)胞周期蛋白E2F-1的表達(dá)相關(guān).同時(shí)在對(duì)白血病細(xì)胞系研究中發(fā)現(xiàn),苦參堿可以抑制K562細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)

3、其分化,此外苦參堿對(duì)多藥耐藥細(xì)胞株K562/vin,K562/dox也具有誘導(dǎo)凋亡作用.在動(dòng)物試驗(yàn)中,苦參堿顯示了與化療藥物5-Fu的協(xié)同作用.苦參堿的抗腫瘤活性還與抑制環(huán)氧化酶-2及特異性誘導(dǎo)拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ表達(dá)相關(guān).以上研究從不同角度對(duì)苦參堿抗腫瘤機(jī)制進(jìn)行探討,但很少涉及苦參堿發(fā)揮其抗腫瘤作用時(shí)對(duì)蛋白質(zhì)翻譯的影響及相關(guān)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路改變.翻譯是遺傳信息傳遞的最后一步,可分為起始,延伸和終止三個(gè)階段.而起始是翻譯過程中的限速步驟,也是最

4、常見的翻譯調(diào)控目標(biāo).真核細(xì)胞翻譯起始因子(eukaryotic translation initiation factor,eIF)在這種調(diào)控機(jī)制中發(fā)揮重要作用,其數(shù)量、活性及完整性是主要的調(diào)控對(duì)象.翻譯起始中的主要事件是翻譯起始復(fù)合物eIF4F的形成.eIF4.F結(jié)合mRNA 5'端帽子結(jié)構(gòu),由eIF4E、eIF4A和eIF4G三個(gè)部分組成.eIF4E是帽子結(jié)合蛋白,與腳手架蛋白eIF4G相互作用,后者結(jié)合在具有RNA解旋酶功能的eI

5、F4A上.由于eIF4E能夠識(shí)別5'端的7-甲基鳥苷三磷酸,是帽子依賴的翻譯起始過程中最重要的一步,因此受到各種研究的重視.據(jù)報(bào)道影響eIF4E的信號(hào)傳導(dǎo)通路主要有2條,Akt/mTOR(the mammalian target of rapamycin)及MAPK(mitogen-activated.protein kinase)途徑.受到廣泛關(guān)注的雷帕霉素(Rapamicin)即能特異性抑制mTOR途徑影響翻譯.此外eIF4E結(jié)合蛋

6、白(eIF4E-binding proteins,4E-BPs)能通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合eIF4E而抑制翻譯起始復(fù)合物eIF4F的形成.當(dāng)4E-BPs去磷酸化時(shí),它能與eIF4G競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合eIF4E,使其處于無功能狀態(tài).當(dāng)4E-BPs重新磷酸化時(shí),它與eIF4E解離,激活翻譯. 哺乳動(dòng)物細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成易受各種促進(jìn)生長(zhǎng)、抑制生長(zhǎng)因子及壓力環(huán)境的影響.異常的翻譯調(diào)控可以導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化以及翻譯起始因子和信號(hào)傳導(dǎo)通路的改變.目前認(rèn)為在這

7、些翻譯調(diào)控相關(guān)因素的改變是造成蛋白異常表達(dá)的重要原因.翻譯起始過程中最關(guān)鍵的因子eIF4E與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系日益引起人們的關(guān)注.研究發(fā)現(xiàn)eIF4E不僅可以從全局調(diào)節(jié)翻譯速度,還可以增強(qiáng)一些促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡相關(guān)蛋白的翻譯,如癌基因編碼的蛋白和生長(zhǎng)因子.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明,eIF4E過度表達(dá)能促進(jìn)細(xì)胞增殖,并可以誘導(dǎo)惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤發(fā)生.眾多研究證實(shí)elF4E在正常情況下低水平表達(dá),而在多種惡性腫瘤(頭頸部鱗癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌等

8、)組織和腫瘤旁組織中elF4E過度表達(dá),并與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力呈正相關(guān).因此elF4E被認(rèn)為是一種癌基因.Ras是一種小GTP結(jié)合蛋白,它是Raf/MEK/ERK、P13K/Akt等眾多信號(hào)傳導(dǎo)通路的常見上游調(diào)控分子,導(dǎo)致Raf/MEK/ERK、P13K/Akt的級(jí)聯(lián)反應(yīng).ras基因突變是腫瘤發(fā)生過程中的早期事件.ras基因突變?cè)谀[瘤中是廣泛存在的.據(jù)報(bào)道大約30﹪的腫瘤檢測(cè)到ras基因突變,胃癌中的ras突變也有較多報(bào)道,其突變率在2

9、.8-18.5﹪之間.研究表明ras基因突變可以引起Ras蛋白持續(xù)性的活化,最終導(dǎo)致細(xì)胞不受控制的增殖.研究認(rèn)為Ras參與了elF4E誘導(dǎo)的惡性轉(zhuǎn)化,.Ras介導(dǎo)的細(xì)胞生存必須依靠elF4E依賴的蛋白合成. 第一部分苦參堿可通過調(diào)節(jié)翻譯起始因子elF4E和4E-BPI抑制胃癌細(xì)胞MKN45的增殖 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同濃度苦參堿(0.05,0.10,0.25,0.50,1.0mg/m1)對(duì)胃癌細(xì)胞MKN45有增殖抑制作用,并呈濃

10、度依賴性和時(shí)間依賴性.MKN45細(xì)胞經(jīng)苦參堿處理48h,其IC<,50>值為0.53mg/ml.流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)苦參堿誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡呈濃度依賴性,0.50mg/ml時(shí)達(dá)到最高凋亡率26.88﹪.在0至0.25mg/ml濃度范圍內(nèi),MKN45細(xì)胞自G0/G1期比例有升高,可能存在G0/G1期阻滯.研究還發(fā)現(xiàn)MKN45細(xì)胞經(jīng)不同濃度的苦參堿作用48小時(shí)后,eIF4E的磷酸化水平明顯下降,并存在量效關(guān)系和時(shí)間依賴性.eIF4E的結(jié)合蛋白4E-

11、BP1也出現(xiàn)了類似的結(jié)果,即磷酸化水平呈濃度和時(shí)間依賴性下降,不同的是,經(jīng)苦參堿作用后,4E-BP1的表達(dá)總量也有升高.由于elF2磷酸化的α亞單位能夠穩(wěn)定eIF2-GDP-eIF2B復(fù)合物,為此還檢測(cè)了elF2 α的活性,結(jié)果未發(fā)現(xiàn)eIF2磷酸化水平的改變.提示苦參堿可能通過減弱eIF4E和4E-BP1的磷酸化水平,影響MKN45細(xì)胞的翻譯起始過程. 第二部分苦參堿可通過減弱Erk1/2活性抑制MKN45細(xì)胞的翻譯起始

12、 Akt/mTOR及MAPK途徑是調(diào)控4E-BP1和leIF4E活性的主要兩條信號(hào)傳導(dǎo)通路.本研究發(fā)現(xiàn)各濃度的苦參堿均可以抑制Erk1/2 MAPK的活性,且與4E-BP1和eIF4E磷酸化水平相對(duì)一致,結(jié)果表明苦參堿可通過抑制Erk1/2MAPK減弱4E-BP1和eIF4E的磷酸化;而苦參堿對(duì)p38MAPK的活性無明顯影響,JNK、Akt、mTOR的活性(磷酸化水平)改變與4E-BP1和eIF4E表現(xiàn)不一致,提示相互無關(guān).研究還發(fā)

13、現(xiàn)抑制PP2A活性使苦參堿處理組細(xì)胞及對(duì)照組細(xì)胞的4E-BP1磷酸化水平明顯下降,推測(cè)PP2A可能參與此過程. 第三部分Ras異常表達(dá)的胃癌細(xì)胞AGS的建立及苦參堿對(duì)其的增殖影響的研究 Ras活化在胃腸道腫瘤的發(fā)生演變中具有重要作用,目前缺乏能應(yīng)用于臨床的Ras特異性抑制劑.為研究苦參堿對(duì)Ras異?；罨哪[瘤細(xì)胞抑制作用,實(shí)驗(yàn)運(yùn)用RT-PCR技術(shù)克隆H-Ras序列(571bp,BC095471),構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒H-

14、Ras-pcDNA3.1(-).因MKN45細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率低下,所以選擇AGS細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,建立H-Ras-pcDNA3.1(-)-AGS(簡(jiǎn)稱R-AGS)和pcDNA3.1(-)-AGS(簡(jiǎn)稱P-AGS). 經(jīng)Western blot法鑒定,與P-AGS及AGS相比,R-AGS高表達(dá)H-Ras.用MTT法測(cè)定不同濃度苦參堿對(duì)AGS、p-AGS、及R-AGS的增殖抑制率,發(fā)現(xiàn)AGS、p-AGS、R-AGS細(xì)胞的增殖均受到了明顯

15、的抑制,并呈劑量依賴性(ANOVA,P均小于0.001).軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)表明,三種細(xì)胞之間的克隆密度均存在顯著性差異(Univariate,P均小于0.001),R-AGS組與P-AGS組、AGS組比較,具有更高的克隆形成率,R-AGS組克隆密度高,而克隆體積較小;p-AGS組克隆密度低,但是克隆體積較大;AGS組的克隆密度居兩者之間,而體積與R-AGS相似.經(jīng)克隆計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn),僅在0.5mg/ml苦參堿處理時(shí),R-AGS克隆形成數(shù)與其

16、余4個(gè)濃度相比均存在顯著性差異(Dunnett t test,p均低于0.001),但在P-AGS組、AGS組也觀察到類似的現(xiàn)象(Dunnett t test,p均低于0.001),同時(shí)發(fā)現(xiàn)苦參堿對(duì)三種細(xì)胞的克隆形成抑制率沒有顯著性差異(ANCVA,P>0.05),均提示Ras不是苦參堿的作用靶點(diǎn).苦參堿在較高的濃度時(shí)對(duì)Ras異常表達(dá)的胃癌細(xì)胞AGS生長(zhǎng)有一定的抑制作用,但與p-AGS、AGS細(xì)胞相比,苦參堿并沒有表現(xiàn)出對(duì)R-AGS的克

17、隆形成具有更高的抑制能力,提示苦參堿的非Ras依賴作用. 結(jié)論： 1.證明苦參堿抑制胃癌細(xì)胞系MKN45翻譯起始因子eIF4E和抑制蛋白4E-BP的磷酸化水平,呈劑量和時(shí)間依賴性,提示eIF4E和4E-BP可能是苦參堿抗腫瘤作用的新靶點(diǎn). 2.發(fā)現(xiàn)苦參堿可減弱Erk1/2 MAPK活性,并與eIF4E和4E-BP的磷酸化水平改變相對(duì)一致,表明苦參堿可通過抑制Erk1/2MAPK減弱4E-BP1和eIF4E的磷酸