氧化苦參堿通過miR-125B-STAT3途徑抑制卵巢癌細(xì)胞增殖與侵襲的研究.pdf

1、目的:上皮性卵巢癌是婦科生殖道腫瘤中致死率最高的一種惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計2015年美國將有21290例新發(fā)病例和14180例死亡病例。
　　已有多項研究表明，miRNA是許多生理過程的主要調(diào)控者，參與胚胎發(fā)育、器官形成，以及細(xì)胞的增殖、分化、細(xì)胞周期進(jìn)程及凋亡等。其異常表達(dá)常與許多疾病包括癌癥的發(fā)生有關(guān)。在腫瘤中，miRNAs常常發(fā)生擴(kuò)增或缺失，導(dǎo)致腫瘤抑制蛋白的表達(dá)減少或癌蛋白的過度表達(dá)。許多miRNA位于基因組的脆性位點或腫瘤相關(guān)

2、區(qū)域，如染色體斷裂點的區(qū)域、發(fā)生雜合性缺失的區(qū)域、以及發(fā)生擴(kuò)增和重排的區(qū)域等。因此，特定miRNA的表達(dá)異常與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。其中miRNA125b(miR-125b)在癌癥研究領(lǐng)域引起了學(xué)者們的關(guān)注。成熟的miR-125b由miR-125b-1和miR-125b-2兩個基因產(chǎn)生，這兩個基因都位于染色體的脆性部位，在乳腺癌、卵巢癌和宮頸癌中常發(fā)生缺失。全基因組miRNA表達(dá)譜分析表明miR-125b在卵巢癌中是異常表達(dá)的。已有研究表明

3、在裸鼠中miR-125b的過表達(dá)可以降低人卵巢癌細(xì)胞的增殖，抑制卵巢癌細(xì)胞的生長，miR-125b的降調(diào)與卵巢癌細(xì)胞的侵襲增強(qiáng)和不良預(yù)后有關(guān)。這說明miR-125b的異常表達(dá)在卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程中的重要作用，但其下游靶基因及詳細(xì)作用機(jī)制尚待闡明。我們應(yīng)用生物信息學(xué)工具Pictar(http://pictar.Bio.nyu.edu/), Targetscan(http//www.targetscan.org/)，以及MiRanda(ht

4、tp://www.Microma.org/)等對miR-125b的可能靶基因進(jìn)行了預(yù)測，預(yù)測結(jié)果顯示:STAT3(The transcription factor signal transducer and activatorof transcription3)編碼區(qū)存在miR-125b的作用靶點，因此STAT3很可能是miR-125b的下游靶基因，但調(diào)控作用尚需進(jìn)一步驗證。
　　信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(Signal Transd

5、ucer and Activator of Transcr-iption，STAT)家族是潛在的胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞中既能傳遞胞漿信號又起到啟動核內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄的功能。其中STAT3(The transcription factorsignal transducer and activator of transcription3)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路直接影響細(xì)胞的增殖、分化及凋亡過程。在正常情況下，STAT3蛋白的激活是快速的、短暫的。該通路異常活

6、化可導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化。在人類許多類型的腫瘤中，均有其異常的持續(xù)激活和高表達(dá)，從而通過c-myc、cyclinD1、survivin和Bcl家族等途徑促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡。許多癌癥細(xì)胞株和原發(fā)腫瘤包括卵巢癌中都報道有持續(xù)激活的STAT3(pSTAT3)，導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤發(fā)生。
　　氧化苦參堿(oxymatrine，OMT)分子式C15H24N2O2，分子量為264.36，是傳統(tǒng)中藥苦參的有效成分，屬于四環(huán)喹諾里西啶

7、類(quinol-izidine)生物堿，性寒味苦，有清熱解毒，明目止淚，燥濕利尿，祛風(fēng)殺蟲，安五臟，轉(zhuǎn)身定志等作用。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明其具有較好的抗腫瘤活性，還具有抗炎、抗病毒、抗纖維化、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用。近年來其抗腫瘤活性引起了學(xué)者們的關(guān)注。體外實驗表明氧化苦參堿能抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)周期阻滯、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化、抗腫瘤新生血管形成以及抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移，對多種腫瘤細(xì)胞具有殺傷或抑制作用。目前其針對肝癌細(xì)胞、白血病細(xì)胞

8、的研究較為廣泛，對腸癌、宮頸癌、卵巢癌的研究也有報道，但多停留于表象，缺乏對其分子機(jī)制的深入研究。
　　卵巢癌是一種異質(zhì)性疾病，其病理類型較為復(fù)雜。其中上皮性卵巢癌占原發(fā)卵巢腫瘤的90％，主要分為漿液性、粘液性、子宮內(nèi)膜樣、透明細(xì)胞、移行細(xì)胞、混合性和未分化癌。漿液性卵巢癌占卵巢癌的75％。不同亞型的卵巢癌具有不同的分子改變及不同的生物學(xué)特性，對藥物反應(yīng)也不盡相同。在本實驗中我們選取常見的漿液性卵巢癌細(xì)胞株SKOV3，觀察OMT能

9、否抑制其增殖及侵襲，并探討其作用的分子機(jī)制是否通過miR-125b-STAT3途徑。
　　方法:
　　1.選取FIGOⅢ期漿液性卵巢癌組織標(biāo)本5例，取正常卵巢組織為對照，采用RT-PCR法分別測定兩種組織中miR-125b及STAT3mRNA的表達(dá)，用Western blot測定兩種組織中STAT3的蛋白表達(dá)水平，初步探討miR-125b及STAT3分別在漿液性卵巢癌組織與正常卵巢組織中表達(dá)的差異性。
　　2.為研究O

10、MT應(yīng)用于卵巢癌治療的可行性，本研究在細(xì)胞水平探討OMT對SKOV3細(xì)胞增殖、侵襲能力的影響，選取不同濃度OMT作用于SKOV3細(xì)胞不同時間后，采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測OMT對SKOV3細(xì)胞生長的影響;采用Transwell小室檢測OMT對SKOV3細(xì)胞侵襲能力的影響。
　　3.不同濃度的OMT作用于SKOV3細(xì)胞后，采用RT-PCR及Westernblot方法檢測細(xì)胞中VEGF、cyclinD1、p21、p27以及MM

11、P2/MMP9表達(dá)情況的變化，探討OMT對SKOV3細(xì)胞增殖與侵襲能力影響的的分子機(jī)制。
　　4.為進(jìn)一步研究OMT對SKOV3細(xì)胞增殖與侵襲能力影響的作用機(jī)制，本實驗采用了RT-PCR及Western blot方法分別檢測不同濃度OMT作用于SKOV3細(xì)胞后miR-125b的表達(dá)情況以及STAT3 mRNA、蛋白的表達(dá)情況。
　　5.分別將miR-125b-mimic、anti-miR-125b轉(zhuǎn)染至SKOV3細(xì)胞中，檢測

12、相應(yīng)的STAT3 mRNA、蛋白的變化及對SKOV3細(xì)胞增殖與侵襲能力的影響。
　　結(jié)果:
　　1.RT-PCR及Western blot檢測結(jié)果均提示，漿液性卵巢癌組織中miR-125b的表達(dá)水平明顯低于正常卵巢組織，而STAT3的表達(dá)水平明顯高于正常卵巢組織。
　　2.不同濃度OMT作用于SKOV3細(xì)胞不同時間后，OMT組SKOV3細(xì)胞的OD值均較對照組明顯減低，且表現(xiàn)出時間濃度依賴性。同時，Transwell小室

13、實驗結(jié)果顯示，不同濃度OMT作用于SKOV3細(xì)胞不同時間后，OMT組的穿膜細(xì)胞數(shù)均明顯少于對照組。
　　3.不同濃度的OMT作用于SKOV3細(xì)胞后，VEGF、cyclinD1的表達(dá)水平均低于對照組，且隨著OMT濃度的升高，VEGF、cyclinD1的表達(dá)逐漸降低，呈現(xiàn)濃度依賴性。不同濃度的OMT作用于SKOV3細(xì)胞后，p21、p27的表達(dá)水平均高于對照組，且隨著OMT濃度的升高，p21、p27的表達(dá)逐漸升高，呈現(xiàn)濃度依賴性。

14、>　　不同濃度的OMT作用于SKOV3細(xì)胞后，MMP2，MMP9的表達(dá)水平均低于對照組，且隨著OMT濃度的升高，MMP2，MMP9的表達(dá)逐漸降低，呈現(xiàn)濃度依賴性。
　　4.不同濃度的OMT作用于SKOV3細(xì)胞后，miR-125b的表達(dá)均較對照組明顯升高，且隨著OMT濃度的增高，miR-125b的表達(dá)逐漸升高;而STAT3 mRNA的表達(dá)均較對照組明顯降低，且隨著OMT濃度的增高，STAT3 mRNA的表達(dá)逐漸降低，與miR-125

15、b呈現(xiàn)反向變化。Western blot結(jié)果顯示，不同濃度的OMT作用于SKOV3細(xì)胞后，STAT3蛋白的表達(dá)均明顯低于對照組，與以上PCR結(jié)果相一致，隨著OMT濃度的增高，STAT3蛋白的表達(dá)逐漸降低，呈現(xiàn)濃度依賴性。
　　5.當(dāng)SKOV3細(xì)胞成功轉(zhuǎn)染miR-125b-mimic后，STAT3 mRNA及蛋白的表達(dá)均較對照組明顯降低。采用MTT法檢測miR-125b-mimic組與對照組SKOV3細(xì)胞的OD值變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，

16、miR-125b-mimic組的OD值均明顯低于對照組;同時，Transwell小室實驗結(jié)果表明miR-125b-mimic組SKOV3細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)顯著少于對照組。然而，在轉(zhuǎn)染anti-miR-125b的SKOV3細(xì)胞中，STAT3mRNA及蛋白的表達(dá)均較對照組明顯升高。MTT實驗顯示anti-miR-125b組SKOV3細(xì)胞的OD值明顯高于對照組，Transwell小室結(jié)果顯示，anti-miR-125b組SKOV3細(xì)胞的跨膜數(shù)明

17、顯高于對照組。推測OMT可能通過miR-125b影響SKOV3細(xì)胞的增殖、侵襲能力。
　　結(jié)論:
　　1.氧化苦參堿對卵巢癌SKOV3細(xì)胞的增殖及侵襲具有抑制作用。
　　2.氧化苦參堿可能是通過miR-125b-STAT3途徑調(diào)控STAT3相關(guān)的增殖基因VEGF、cylclinD1、p21、p27及STAT3相關(guān)的侵襲基因MMP2、MMP9的來抑制SKOV3細(xì)胞的增殖和侵襲能力。
　　3.miR-125b-STA