k-ras野生型大腸癌發(fā)生與mapk•jnk的關系

1、二、立論依據(jù)二、立論依據(jù)（包括項目的研究意義、國內外研究現(xiàn)狀分析，并附主要參考文獻及出處）對基礎研究，著重結合國際科學發(fā)展趨勢，論述項目的科學意義；對應用基礎研究，著重結合學科前沿、圍繞國民經(jīng)濟和社會發(fā)展中的重要科技問題，論述其應用前景。關于大腸癌的發(fā)生，長期以來認為有兩種學說，即：adenomacarcinomasequence學說［１］(先有良性腺瘤，之后一部發(fā)生癌變)和denovo學說［２］(直接從正常粘膜發(fā)生癌變)。Vogels

2、tein于1988年對正常組織腺瘤癌組織進行了詳細解析，完成了adenomacarcinomasequence(polypcarcinomasequence)的多階段發(fā)癌模型［１］，即：在小的腺瘤階段Cmyc發(fā)生異常，隨著腺瘤增大Kras基因出現(xiàn)點突變及P53，DCC等基因異常使腫瘤的一部分發(fā)生癌變。這一機制基本清楚。而denovo型發(fā)癌機制還不清楚。日本學者藤盛孝博教授(申請者的指導教授)的分子生物學實驗結果揭示，在denovo型發(fā)癌

3、過程中，Kras基因基本不參與，此型癌的發(fā)生可能是由Kras以外的其他未知的癌基因參與所致。Ras基因作為人類大腸癌發(fā)癌的重要基因被廣泛研究。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，Kras基因的突變(Kras活性型)在人大腸癌的檢出率為4050%［4，5］，而其余5060%的不伴有Kras基因點突變(Kras野生型)大腸癌(其中一部為denovo型發(fā)癌者)的發(fā)生被認為是由Kras基因以外的未知癌基因所致［３］。研究證明，Ras基因作為細胞增殖與分化的信號傳導啟動子

4、起重要作用。它的靶蛋白有Raf、MEKK及P23激酶等。其中，古典的MAPK(mitogenactivatedproteinkinase)信號傳導系(Ras→Raf1→MEK→MAPK)在細胞增殖，分化及發(fā)癌過程中起重要作用。它們具有傳導上位特異的激酶依次磷酸化和激活下位特異激酶的特性。即：Ras活性型激活Raf(MAPKKK)Raf激活MEK(MAPKK)，MEK激活MAPK。然后，由小分子的MAPK將信息轉入細胞核內，引起細胞核內染

5、色體改變。因此，MAPK的活性可能在細胞質和細胞核的信號傳遞中起到一個連接作用［５］。新近的研究提示“MAPK的活性異?？赡芘c發(fā)癌有關［6，7］。一些纖維母細胞株的實驗結果提示，作為MAPK的新家族成員的JNK(cJunNterminalKinase)信號傳導系也受Ras活化的影響，可能參與Ras活性型細胞癌變［8。9］。近年的研究雖然提示MAPK，JNK參與了細胞癌變，但人大腸癌與KrasRaf1MEKMAPK以及與JNK傳導系間關系

6、尚不清楚［10。11。12，13，14］。尤其是Kras野生型及Kras活性型大腸癌與MAPK及JNK信號傳導系間關系方面的研究尚未見報道。倘若在大腸癌中(尤其在Kras野生型)發(fā)現(xiàn)有MAPK或JNK等蛋白激酶信號傳導異常(蛋白過表達，磷酸化或發(fā)現(xiàn)其點突變)，將會對闡明大腸癌的發(fā)生機制，特別是為探討Kras野生型大腸癌、denovo型癌發(fā)生機制提供有力依據(jù)。此乃本項目的主要意義所在。近來研究還表明大腸癌的Krascodon13點突變與大

7、腸癌預后有關［１5］。就是說Kras基因變異可能是判定大腸癌預后一個重要指標。在我們最近的實驗中，不論在大腸癌細胞株，還是在大腸癌組織內均發(fā)現(xiàn)了MAPK的活性。有趣的是，KrasCodon13有突變的大腸癌組織及細胞株內MAPK活性均低于正常組織。這些都提示此類型大腸癌的癌變可能是通過不同于RasMAPK途徑的其它方式(JNK)發(fā)生的；與Kras有關的MAPK及JNK信號傳導蛋白激酶可能參與了大腸癌的發(fā)生，可能會對大腸癌的分期、病理類型

8、、轉移和預后的判定提供分子生物學依據(jù)，對這些問題的探討也是本研究的目的和意義之一。－31－三、研究方案三、研究方案1.研究目標、研究內容和擬解決的關鍵問題研究目標：1)研究MAPK、JNK等信號傳導系蛋白激酶的活性與Kras野生型(KrasWT)及Kras活性型人類大腸癌發(fā)生的關系，探討人大腸癌發(fā)生機制；尤其要闡明Kras野生型大腸癌的發(fā)生機制，為研討denovo型大腸癌發(fā)生機制提供分子生物學依據(jù)。2)比較和探討MAPK、JNK等信號傳

9、導系蛋白激酶的活性及Kras的變異與大腸癌的臨床病理特征(病期、類型、浸潤、轉移及預后)的相關關系，為臨床診療及預后判定提供分子生物學依據(jù)。研究內容：本實驗通過分子生物學手段將人大腸癌(組織及細胞株)分為Kras野生型和Kras活性型；用特異抗體(westernblot法)測定和比較兩型大腸癌的MAPK及JNK信號傳導系各蛋白激酶的活性，從而探討Kras及MAPKJNK信號傳導系與大腸癌發(fā)生及臨床病理特征的關系。一、人大腸癌的Kras基

10、因的分類(野生型和活性型)及分布的研究。二、測定Kras野生型及Kras活性型大腸癌的各自下位信號傳導蛋白激酶Raf1MEKMAPK等的活性水平。并比較這些蛋白激酶與此兩型(尤其是Kras野生型)大腸癌發(fā)生的相互關系。三、人大腸癌的KrasCodon12、13、61出現(xiàn)的點突變與MAPK等蛋白激酶活性間的關系。四、KrasCodon13有點突變的大腸癌與JNK信號傳導系蛋白激酶活性間的關系。五、比較上述諸蛋白激酶的活性、突變與人大腸癌不