重組子的篩選與鑒定

1、第七章 重組子的篩選與鑒定,第一節(jié) 遺傳學檢測法第二節(jié) 核酸分子雜交檢測法第三節(jié) 電泳檢測法第四節(jié) 免疫化學檢測法第五節(jié) 核酸序列分析及其他方法,,將目的DNA片段與載體連接形成重組子，然后通過各種方法將重組子導人宿主細胞。得到所需要的帶有重組DNA的轉化子是基因工程的目的所在。轉化子就是導入外源DNA后獲得了新的遺傳標志的細菌細胞或其他受體細胞。在轉化反應中，并非所有的細胞都轉入重組DNA分子，即使所有的受體細胞

2、都變?yōu)檗D化體，所獲得的轉化子仍是多種類型的DNA分子，因為在連接產物中既有裁體和一個或數個串聯目的基因的連接，也有載體的自連，還有目的DNA分子的自連，更多的是未發(fā)生連接反應的載體和目的DNA片段。,,因此在成千上萬個轉化子中，真正含有期望的重組DNA分子的比例很少，為了將含有外源DNA的宿主細胞和不含外源DNA宿主細胞分開，以及將含有正確重組子的宿主細胞和含有其他外源DNA的宿主細胞分開。這就需要設計出容易于篩選重組子克隆的方案并加以

3、驗證，這就是我們這一章要討論的內容。,,陽性克隆的篩選與鑒定可以從不同的層次、利用不同的方法進行?？偟膩碚f，重組子的鑒定可以從直接和間接兩個方面分析，可以從DNA、RNA和蛋白質三個不同的水平進行鑒定。,第一節(jié) 遺傳學檢測法,1 根據栽體表型特征的篩選2 根據插入基因遺傳性狀的篩選,1 根據栽體表型特征的篩選,根據載體分子所提供的表型特征，選擇重組體DNA分子的遺傳選擇法，可適用于大量群體的篩選，因此是一種比較簡單而又十分有效的方法

4、。,,含有一個選擇標記:實際操作中，最典型的方法是使用抗藥性標記的插入失活作用，或是β—半乳糖苷酶基因的顯色反應，將重組體DNA分子的轉化子同非重組的載體轉化子區(qū)別開來。對λ噬菌體的置換型載體來說。λ噬菌體頭部外殼蛋白容納DNA的能力是有一定限度的。其包裝能力應控制在野生型λDNA長度的75％一105％之間(36—51kb)，這樣才能形成噬菌斑。因此，包裝限制這一特性，保證了體外重組所形成的有活性的λ重組體分子，一般都應帶有外源DNA

5、的插入片段，λ噬菌斑的形成本身就是對λ重組體的一種篩選特征。,1.1抗藥性標記及其插入失活選擇法,在PBR322質粒上有兩個抗生隸抗性基因，Tetr上有插入位點BamH I和Sal I; Ampr上有插入位點Pst I。,四環(huán)素：,氨芐青霉素抗性基因：,產生?-內酰胺酶，使氨芐青霉素轉變?yōu)榍嗝雇?，使?青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）（藍灰色）褪色。,抑制細菌生長，但不殺死細菌。,殺死生長的細菌，但不殺死停止生長

6、的細菌。,環(huán)絲氨酸：,當外源DNA限制片段插入pBR322質粒的BamH I和Sal I位點時，抗四環(huán)素基因失活，重組體轉化子必定具有Ampr Tets表型。將轉化菌先涂布在含有Ampr的瓊脂平板上并將存活的Ampr菌落原位影印到另一個含有Tet的瓊脂平板上，凡是在Ampr平板上生長，而不在Tet平板亡生長的菌落，就必定是已經插入了外源DNA限制片段的重組質粒轉化子克隆。,（1）四環(huán)素抗性插入失活,,如果在Tetr上插入外源DNA，導致

7、四環(huán)素抗性基因失活，可用四環(huán)素加環(huán)絲氨酸平板培養(yǎng)基選擇重組克隆。,Tetr失活的菌生長被四環(huán)素抑制，不被環(huán)絲氨酸殺死，保留下來； Tetr不失活的菌抗四環(huán)素，能分裂生長，反而被環(huán)絲氨酸殺死。,,,（2）氨芐青霉素抗性插入失活選擇過程,如果Ampr上插入外源DNA，導致氨芐青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液選擇。,1.2 ?-半乳糖苷酶顯色反應選擇法,1.2.1. 原理：載體上有一段?-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的?片段（氨

8、基端），其上有外源DNA的插入位點。 受體菌基因組中有突變的?-半乳糖苷酶基因（ ?片段缺失）?？梢员籌PTG誘導表達。 載體和受體菌基因組可以互補形成完整有功能的?-半乳糖苷酶。?-半乳糖苷酶能把無色的化合物Xgal分解成半乳糖和一個深藍色的物質5-溴-4-氯靛藍。,Xgal,,半乳糖,,,5-溴-4-氯靛藍,?-半乳糖苷酶,,載體上LacZ’的5’端有一段多克隆位點(MCS)區(qū)，本身雖不干擾LacZ’的合成，但插入外源基因就會阻止L

9、acZ’的合成。不能互補。,2 根據插入基因遺傳性狀的篩選,重組體DNA分子轉化到大腸桿菌受體細胞之后，如果插入在載體分子上的外源基因能夠實現其功能性的表達，而且表達的產物能與大腸桿菌菌株的營養(yǎng)缺陷突變形成互補，那么就可以利用營養(yǎng)突變株進行篩選。,,營養(yǎng)缺陷型（auxotroph）是指原菌株由于發(fā)生基因突變，致使合成途徑中某一步驟發(fā)生缺陷，從而喪失了合成某些物質的能力，必須在培養(yǎng)中外源補加該營養(yǎng)物質才能生長的突變型菌株。例如．當外源目

10、的基因為合成亮氨酸的基因時，將該基因重組后轉入缺少亮氨酸合成酶基因的菌株中，在僅僅缺少亮氨酸的基本培養(yǎng)基上篩選，只有能利用表達產物亮氨酸合成酶的菌株存活。,第二節(jié) 核酸分子雜交檢測法,1 原理 2 核酸雜交檢測方法,,利用堿基配對的原理進行分子雜交是核酸分析的重要手段，也是鑒定基因重組體的常用方法。雜交的雙方是待測的核酸序列和由插入片段基因制備的DNA或RNA探針。這些方法都是通過一定的物理方法將菌落(噬菌斑)或提取的DNA從平板

11、或凝膠上轉移到固體支持物上，然后同液體中的探針進行雜交。菌落(噬菌斑)或DNA從平板或凝膠向濾膜轉移的過程稱為印跡，故這些雜交又都稱為印跡(blotting)雜交。,1.1 核酸雜交,1、原理：,重組克隆與探針雜交。,1.3 識別標記,32P 或 3H 35S。,（1）放射性同位素,1.2 檢測用的探針,與外源DNA插入片斷互補的序列。,（2）非放射性標記,熒光素,,根據待測核酸的來源以及將其分子結合到固體支持物上的不同，核酸雜交主要

12、有 菌落印跡原位雜交 斑點(dot)印跡雜交 Southern印跡雜交 Northern blotting,2、核酸雜交檢測方法,2.1 Southern blotting,Southern印跡雜交是由E Southern于1975年首先建立并使用的，故名之。它是根據毛細管作用的原理，使在電泳凝膠中分離的DNA片段轉移并結合在適當的濾膜上，然后通過與已標記的單鏈DNA或RNA探針的雜交作用以檢測這些被轉移的 DNA片段

13、。 Southern印跡雜交是針對DNA分子進行的印跡雜交技術，有時又稱為DNA印跡雜交或Southern DNA印跡雜交等。,Southern blotting過程,①將進行DNA電泳分離的瓊脂糖凝膠，經過堿變性等預處理之后平鋪在用電泳緩沖液飽和了的兩張濾紙上，在凝膠上部覆蓋一張硝酸纖維素濾膜，接著加上一疊干燥濾紙或吸水紙，最后再壓上一重物。②在80℃下烘烤1-2h, 使DNA片段穩(wěn)定地固定在硝酸纖維素濾膜上。,,由于干燥濾紙或吸

14、水紙的虹吸作用，凝膠中的單鏈 DNA便隨著電泳緩沖液一起轉移，一旦同硝酸纖維素濾膜接觸，就會牢固地結合在它的上面，這樣在凝膠中的DNA片段就會按原譜帶模式吸印到濾膜上。,,③然后將此濾膜移放在加有放射性同位素標記探針的溶液中進行核酸雜交。這些探針是同被吸印的DNA 序列互補的RNA或單鏈DNA。一旦同濾膜上的單鏈DNA雜交之后，可以牢固結合。 ④漂洗去除游離的沒有雜交上的探針分子，經放射自顯影后，便可鑒定出與探針的核昔酸序列同源的待測

15、DNA片段。據此可以將含有外源DNA片段的重組子篩選出來。,,,,酶切前,酶切后,插入片斷,載體,Southern blot 篩選結果,,2.2菌落印跡原位雜交,是直接把菌落或噬菌斑印跡轉移到硝酸纖維素濾膜上，不必進行核酸分離純化、內切酶酶解及電泳分離等操作，而是經溶菌和變性處理后使DNA暴露出來并與濾膜原位結合，再與特異性DNA或RNA探針雜交，篩選出含有插入序列的菌落或噬菌斑。由于生長在培養(yǎng)基平極上的菌落或噬菌斑，是按照其原來的位置

16、不變地轉移到濾膜上，然后在原位發(fā)生溶菌、DNA變性和雜交作用，所以菌落雜交或噬菌斑雜交隸屬原位雜交范疇。以菌落原位雜交為例，操作步驟如下:,,①將硝酸纖維素濾膜鋪放在生長著轉化菌落的平板表面，使其中的質粒DNA轉移到濾膜上。②作好標記，小心取出濾膜，將吸附菌體的一面朝上放置在預先被強堿溶液浸濕的普通濾紙上進行溶菌和堿變性處理。強堿可以裂解細菌，釋放細胞內含物，降解RNA，并使蛋白和DNA變性。③將濾膜轉移至預先被中性緩沖液浸濕的普通

17、濾紙上，中和NaOH 。④將濾膜轉移到清洗緩沖液中短暫浸泡，洗去菌體碎片和蛋白質。,,⑤取出濾膜晾干，置于80℃下干燥，使單鏈DNA牢固地結合在硝酸纖維素濾膜上。⑥將濾膜轉入探針溶液中，進行雜交反應。⑦雜交反應結束后，清洗濾膜，除去未特異性雜交的探針，然后晾干。 ⑧將濾膜與X線片壓緊置于暗箱內曝光，由膠片上感光斑點的位置，在原始平板上挑出相應的陽性重組子菌落,特點：對應的菌斑或噬菌斑位置不變，可以直接找出陽性菌落。,,,2.3

18、斑點印跡雜交,如果只要檢測克隆菌株、動植物細胞株或轉基因個體、器官、組織提取的總DNA或RNA樣品中是否含有目的基因，則可采用斑點印跡雜交(dot blotting)或狹線印跡雜交(slot blotting)進行檢測，它們是在 Southern印跡雜交的基礎上發(fā)展的兩種相似的快速檢測特異核酸(DNA或RNA)分子的核酸雜交技術。,,斑點雜交法與菌落原位雜交的原理一樣，但方法更簡單、迅速，可直接將噬菌體的上清液或是由轉化子提取的DNA(

19、RNA)樣品直接點在硝酸纖維素濾膜等固體支持物上，與探針進行分子雜交。通過放射自顯影，從底片中找出黑點即為陽性斑點。此方法常用于病毒核酸的定量檢測。,2.4 Northern blotting,Northern 印跡雜交是指將RNA分子變性及電泳分離后，從電泳凝膠轉移到固相支持物上進行核酸雜交的方法，又稱為Northern RNA印跡雜交等。該法是在Southern blotting雜交基礎上發(fā)展起來的，主要針對RNA分子的檢測，基

20、本步驟與Southern印跡雜交相似。但RNA分子與 DNA分子有所不同， 一般不能采用堿變性處理，同時，在RNA電泳時必須解決兩個問題：一是防止單鏈RNA形成高級結構，故必須采用變性凝膠電泳；二是電泳過程中始終要有效抑制RNase的作用，防止RNA分子的降解破壞。,用DNA（或RNA）探針檢測RNA樣品。,主要檢測插入片斷是否被轉錄。,從宿主細胞中提取RNA，再用探針雜交。,第三節(jié) 電泳檢測法,1直接凝膠電泳檢測法 2 切酶酶切片

21、段電泳分析法3 PCR擴增檢測法,利用有插入片段的重組載體的分子量比野生型載體分子量大。,1、直接電泳檢測法,從轉化后的菌體克隆中分離質粒，電泳、比較其分子量。出現滯后，稱滯后現象,,,,,,,,,,分子量 Marker,載體,,重組克隆,2 限制性核改內切酶酶切片段電泳分析法,2.1 原理：,根據已知的外源DNA序列的限制性酶切圖譜，選擇一兩種內切酶切割質粒，電泳后比較電泳結果（DNA帶數和長度）。,或用合適的內切酶切下插入片斷

22、，再用其它酶切這個片斷，電泳后比較結果是否符合預計的結果。,,A,B,A或B,,,不同克隆的酶切結果,篩選過程,3、PCR擴增檢測法,3.1 原理,PCR能在模板序列上擴增出預期DNA片斷。,3.2 過程,（1）從重組克隆中提取質粒（或DNA）。,（2）用外源DNA插入片斷引物作PCR。,（3）電泳PCR產物。,（4）檢查是否有PCR產物。,（5）PCR產物的長度是否與外源基因一致。,第四節(jié) 免疫化學檢測法,免疫化學檢測法是一種間接

23、的篩選方法，它利用特異性抗體與外源DNA編碼的抗原的相互作用進行篩選，特別適用于檢測不為宿主提供任何檢測標志的基因。使用該方法的前提是插入的外源基因必須在受體細胞中表達，必須具有目的蛋白質的抗體。常見的有放射性抗體檢測法、免疫沉淀檢測法、wetem印跡分析法等,第四節(jié) 免疫化學檢測法,1 放射性抗體檢測法 2 免疫沉淀檢測法 3 酶聯免疫吸附測定（ELISA） 4 western印跡分析法,利用抗體作為“探針”

24、來檢測轉入受體菌并且表達出相應的蛋白質的外源基因。,根據第一抗體（一抗）和第二抗體（二抗）的性質可分為幾種作用方式：,1. 1 抗體與產物的結合方式,對表達產物的檢測。蛋白——蛋白“雜交”,1 放射性抗體檢測法,,待測基因 產物蛋白,一抗,二抗,125I 標記的二 抗結合蛋白,固相支持濾膜,待測基因 產物蛋白,一抗,125I標記的二抗,固相支持濾膜,待測基因 產物蛋白,一抗,固相支持濾膜,固相支持濾膜,待測基因 產物蛋白,一抗

25、,二抗,125I 標記的二抗 結合蛋白,125I標記的二抗,1.2 基本原理及操作步驟,首先將長有轉化子菌落的瓊脂平板影印復制，備用。把原平板放置在氯仿蒸汽中，使細菌菌落裂解，釋放出抗原。將吸附有抗體的固體支持物聚乙烯薄膜輕輕放在先前裂解的菌落上，相互接觸，以利于個別菌落的抗原吸附到抗體上，形成抗原-抗體復合物。取出含有抗原-抗體復合物的聚乙烯薄膜，放入預先用同位素125 I標記的抗體溶液中溫浴，薄膜上的抗原就會與125I標記的抗體相

26、結合。最后經放射自顯影，顯示出抗原與125I標記的抗體結合的位置，并由此確定復制平板上能夠合成抗原的菌落，即重組體菌落,1.2. 放射性抗體檢測法過程,1.3. Broome-Gilbert雙位點檢測法,質?；駻,,插入基因B,,表達,質粒蛋白A,外源蛋白B,融合蛋白,,檢測融合蛋白。,既檢測外源基因產物又檢測載體基因產物。,,固相支 持濾膜,抗A抗體,125I標記的 抗B抗體,質粒蛋白A,外源蛋白B,質粒蛋白A,外源蛋白B,,固

27、相支 持濾膜,抗A抗體,,發(fā)光，底片曝光,,,將補加有抗體和溶菌酶的瓊脂，小心傾注到菌落的上面，并使之凝固。在溶菌酶的作用下，菌落表面的細菌發(fā)生溶菌反應，逐步釋放出細胞內部的蛋白質。如果有某些菌落的細胞能夠分泌出目的基因編碼的蛋白質，它們就會同包含在瓊脂培養(yǎng)基中的抗體發(fā)生反應，在菌落周圍產生白色的沉淀圈。,2.1. 原理,抗原——抗體凝集反應。,是在平板培養(yǎng)基上直接進行免疫反應，以鑒定產生蛋白質的重組菌落，檢測分泌型產物。,2.2.

28、方法,2、免疫沉淀檢測法,,對于不能被分泌到菌體外的蛋白質可先進行原位溶菌處理（溶菌酶、原噬菌體誘發(fā)）。,Enzyme-linked immunosorbant assay,3.1. 原理：,一抗（primary antibody）: 與目標分子的特異結合。 二抗（secondary antibody）： 與一抗的特異性結合。 酶連（enzyme-linke）： 二抗上攜帶一種

29、酶能催化一種反應將無色的底物轉變?yōu)橛猩奈镔|（或發(fā)光），再通過比色測定有色物質的含量（或光強度），從而推測目標分子的含量。,,3 酶聯免疫吸附測定（ELISA）,,待測基因 產物蛋白,一抗,二抗,酶,待測基因 產物蛋白,一抗,二抗,,,,,無色的底物,有色的產物,,,,比色觀察,酶,19,3.2. ELISA檢測的一般步驟,（1）固定樣品,將待測樣品加入96孔微量滴定板（microtiter plate）的孔中，干燥后就被固定在孔底

30、。,孔底,加入一抗，反應后沖洗掉未結合的抗體。,（2）一抗結合,一抗,,,,加入二抗，與一抗結合后再將未結合的二抗沖洗掉。二抗只識別一抗。,二抗上聯著一種酶（堿性磷酸酶、過氧化物酶、脲酶等）。,（3）二抗結合,二抗,,,,加入無色的底物，被二抗上所帶的酶催化反應轉變成有色物質（或發(fā)光）。,（4）顯色反應,,在特殊的分光光度儀（酶標儀）上比色，打印出結果。,（5）比色,3.3.ELISA的局限性,有效，但準確性稍差（主要取決于一抗的特異性

31、）。 必須與其他方法一起綜合考慮。,最好用單克隆抗體（monoclonal antibody）,臨床檢驗常用的單抗,4.1.原理：,在蛋白質凝膠電泳以后，用轉膜和免疫的方法檢測膠上的蛋白質泳帶。,（1）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,是蛋白質的變性劑，使煮沸變性的蛋白質維持線性狀態(tài)，并與蛋白質結合，使蛋白質帶上負電荷。,① SDS:,（SDS-PAGE）：,4 免疫印跡（western blotting）法,② 聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE

32、）：,（Polyacrylamide gel electrophoresis）,在電場的作用下線性蛋白質鏈在聚丙烯酰胺凝膠介質中向正極移動，移動的速率主要取決于其分子量大?。ㄦ湹拈L短），從而把不同分子量的肽鏈分開。,電泳buffer,,電泳buffer,,,點樣,電泳方向,③蛋白質電泳的分子量標準,已知分子量的蛋白質混合液，與待測樣品一起電泳，為樣品蛋白質提供分子量估計。,商品化供應,Da,道爾頓(質量單位, 等于一氧原子質量的十六分之

33、一。 一克約為6×1023道爾頓,,Dalton,SDS PAGE,④凝膠中的蛋白質染色：,考馬斯亮藍： 靈敏度底、只能檢出>0.3-1μg/帶，但可褪色回收。,硝酸銀： 靈敏度高、可檢出2-5ng/帶。,2）轉到膜上進行染色。,1）直接染色,直接染色電泳結果,（2）Western blotting,電泳膠里的蛋白質帶可以用電轉的方法，轉到膜上（硝酸纖維素膜、PVDF膜、中性尼龍膜等）。,① Western（轉膜）

34、,膠里的蛋白質帶在電場的作用下橫向轉移到正極一側的膜上。,,,,,,,膜,膠,,,,蛋白,,Western裝置,② Blotting,原理與ELISA相同。,待測蛋白,硝酸纖 維素膜,一抗,二抗,辣根過氧 化物酶,底物,產物， 并發(fā)出光,,PAGE膠,,待測蛋白,底片曝光,,辣根過氧化物酶：HRPO,,,1）先用一抗（待測蛋白的單克隆抗體）與 膜上的蛋白結合。,2）洗去未結合的一抗。,3）用二抗與一抗結合（二抗上帶

35、有HRPO）。,4）清洗掉未結合的二抗。,5）用HRPO的底物浸泡膜。,6）暗室里曝光，沖洗膠片。,③ Blotting過程,Immuno Blotting,④結果,多克隆抗體Blotting的結果,單抗blotting結果,,第五節(jié) 核酸序列分析及其他方法,1 核酸序列分析 2 PCR法 3 Nonthern印跡分析…,1 序列分析,核酸序列分析是指通過一定的方法確定DNA分子上的核苷酸排列順序，也就是測定DNA分子

36、的A、T、G、C的排列順序。測序的結果直接反映了轉化子中有無目的基因的存在。核苷酸序列分析的方法，主要有Maxam-Gilbert化學降解法和Sanger雙脫氧鏈終止法(酶法)。這兩種方法對DNA測序的原理不相同，但都建立在高分辨率的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術之上，將差別僅有一個核苷酸的單鏈DNA區(qū)分開來，其長度可達300-500bp.隨著DNA測序技術的不斷發(fā)展和其重要性的日益提高，DNA序列分析已變得越來越簡單快速，朝著自動化和

37、商品化的方向發(fā)展，從而極大地提高了DNA序列分析的速度及準確性。,2 PCR法,PCR技術以載體或目的基因的序列設計擴增引物進行檢測，具體方法已經在前面講過，在此不再敘述。,3 Northern印跡分析,Northern印跡雜交是檢測特定基因是否轉錄和轉錄的強弱情況。它不但用于基因工程中檢測目的基因的轉錄情況，而且已廣泛用于功能基因調控的研究。具體方法是從細胞中提取mRNA，經電泳將不同大小的mRNA分子分開后，印跡轉移于硝酸纖維素膜

38、或尼龍膜上，與特定的探針DNA雜交后，洗去未雜交上的標記探針DNA。經放射自顯影顯帶，根據帶密度的強弱就可確定其表達的相對值。,,1 什么是重組子篩選?主要有那些方法?2 一個攜帶有氨芐青霉素和卡那霉素抗性基因的質粒被僅在卡那霧素基因中有識別位點的及”RI消化。消化物與酵母DNA連接后轉化對兩種抗生素都敏感的Ecoli菌株．試問： (1)利用哪一種抗生素抗性選擇接受了質杜的細胞? (2)怎樣區(qū)分接受了插入酵母DNA的質