漆酶在染料脫色和疏水性芳香化合物降解轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用研究.pdf

1、環(huán)境問題是人類21世紀(jì)所面臨的幾個重大問題之一，環(huán)境保護也因此成為許多科技工作者競相研究的課題。隨著生物科學(xué)和生物工程的迅速發(fā)展，生物技術(shù)在環(huán)境保護領(lǐng)域逐漸展示了巨大威力，酶在環(huán)境保護方面的應(yīng)用已呈現(xiàn)出良好的發(fā)展前景。漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，它能夠催化大量的酚類和芳香胺類化合物的氧化，在小分子介體存在下，其氧化底物的范圍還可進一步擴大。由于漆酶作用底物廣，因此它在廢水處理、生物漂白、芳香化合物轉(zhuǎn)化、環(huán)境監(jiān)測等方面具有重要的應(yīng)用價值。

2、
　　 漆酶的酶學(xué)性質(zhì)與其來源有關(guān)，本文研究了Irpex lacteus dft-1漆酶催化染料脫色反應(yīng)的動力學(xué)，考察了反應(yīng)介質(zhì)條件和添加劑對脫色效果的影響，并利用響應(yīng)面法研究了Irpex lacteus dft-1漆酶催化染料RB亮藍(RBBR)脫色過程中多參數(shù)之間的交互作用。本文還考察了不同類型表面活性劑(陽離子型、陰離子型和非離子型)和聚乙二醇(PEG)對漆酶酶學(xué)性質(zhì)影響以及非離子表面活性劑Triton X-100對漆酶催

3、化轉(zhuǎn)化疏水性芳香化合物雙酚A(BPA)的影響及機制，研究了不同類型表面活性劑組成的反膠束體系中漆酶的催化性能，探討了PEG400對AOT/異辛烷/水反膠束中漆酶催化BPA降解轉(zhuǎn)化的影響及其相應(yīng)機制，為進一步研究漆酶在反膠束中催化轉(zhuǎn)化芳香化合物提供了理論基礎(chǔ)。
　　 一、Irpex lacteus dft-1漆酶催化染料廢水脫色
　　 來源不同的漆酶對染料廢水降解和脫色的能力不同，其最佳反應(yīng)條件也不同。由于介體價格較貴，因

4、此尋求無介體的漆酶催化染料脫色體系可以有效地降低染料廢水的處理成本。Irpex lacteus dft-1漆酶是一種新型漆酶。本文選用了三種不同類型的染料，研究了在不加介體的情況下Irpex lacteus dft-1漆酶催化染料脫色反應(yīng)的動力學(xué)，考察了反應(yīng)介質(zhì)條件和添加劑(非離子表面活性劑)對脫色效果的影響。研究表明，Irpex lacteus dft-1漆酶可以在不加介體的情況下對蒽醌染料茜素紅、偶氮染料甲基紅和三芳基甲烷染料溴甲酚

5、綠較好地脫色。染料結(jié)構(gòu)不同，脫色效果不同，而且最佳脫色pH也不同。當(dāng)加入Triton X-100和Brii30后，由于低濃度下它們對漆酶有激活作用和穩(wěn)定化作用，染料脫色率有所提高。
　　 響應(yīng)面方法(RSM)運用了數(shù)學(xué)和統(tǒng)計學(xué)方法，可以用來建立模型、分析多變量間的交互影響作用，目前已經(jīng)被應(yīng)用于許多化學(xué)和生化過程的最佳化和評估獨立變量間的交互影響。本文通過Box-Behnken設(shè)計研究了Irpex lacteus dft-1漆酶催

6、化染料RB亮藍(RBBR)脫色反應(yīng)中不同參數(shù)(溫度、pH、酶濃度和反應(yīng)時間)之間的交互作用，得到了漆酶催化染料RBBR脫色的二次模型。高F值(2279.28)和低P值(＜0.0001)表明該模型是顯著的。結(jié)果表明，酶濃度是影響染料脫色過程的關(guān)鍵因素，pH與溫度的交互作用最為顯著。參數(shù)與響應(yīng)間的高R2值(0.9996)表明響應(yīng)面二次模型在本研究中較為適用。
　　 二、添加劑對水溶液中漆酶催化性能的影響研究
　　 在不同類型

7、的表面活性劑組成的反膠束體系中，酶表現(xiàn)出的催化性能不同。這與反膠束體系的界面性質(zhì)有關(guān)。聚乙二醇(PEG)是一種合成聚合物，能夠溶解于水中，在漆酶轉(zhuǎn)化酚類污染物時，能夠明顯提高酚類物質(zhì)的轉(zhuǎn)化率。為了闡明不同反膠束中漆酶催化性能的差異和PEG對漆酶催化性能的影響，我們選定了三種不同的表面活性劑(陽離子CTAB，陰離子AOT和非離子Triton X-100)和PEG，考察了其對漆酶酶學(xué)性質(zhì)的影響。研究表明，它們在不同濃度下對漆酶活性的影響不同

8、。PEG對漆酶活性沒有影響。非離子表面活性劑Triton X-100在低濃度下對漆酶略有激活作用，而陽離子表面活性劑CTAB和陰離子表面活性劑AOT均抑制漆酶活性。當(dāng)表面活性劑濃度較高時，三種表面活性劑均使酶活性降低。PEG對漆酶的最佳反應(yīng)pH沒有影響。CTAB和AOT使漆酶的最佳pH略向低pH值方向移動，而Triton X-100則使其向高pH值方向移動。Triton X-100和PEG沒有引起漆酶最佳反應(yīng)溫度的變化，而加入CTAB和

9、AOT后，最佳反應(yīng)溫度值降低。在水溶液中加入Triton X-100和PEG有利于漆酶的熱穩(wěn)定性提高，而CTAB和AOT使漆酶熱穩(wěn)定性降低。
　　 在非離子表面活性劑TritonX-100存在下，漆酶催化疏水性芳香化合物雙酚A(BPA)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的研究表明，TritonX-100可以明顯提高BPA的轉(zhuǎn)化率，特別是在TritonX-100的臨界膠束濃度(CMC)附近。研究還發(fā)現(xiàn)，TritonX-100的存在可以提高反應(yīng)體系中漆酶的穩(wěn)

10、定性。熒光發(fā)射光譜研究表明，漆酶與TritonX-100間存在著相互作用，且這種相互作用有利于漆酶的折疊并使之穩(wěn)定化。束縛在漆酶表面的TritonX-100避免了反應(yīng)過程中生成的中間體自由基和聚合產(chǎn)物對漆酶的失活作用。通過研究不同酶濃度和不同底物濃度下BPA的轉(zhuǎn)化，我們發(fā)現(xiàn)若要達到相同的轉(zhuǎn)化率，加入TritonX-100后可以明顯降低漆酶的使用量。
　　 三、Irpex lacteus dft-1漆酶在反膠束中的催化性能研究

11、r>　　 對酶工程而言，除了要求酶活性較高外，還要求酶在反應(yīng)體系中有較高的穩(wěn)定性。有關(guān)漆酶在反膠束體系中穩(wěn)定性的研究似乎較少，特別是關(guān)于各影響因素對其穩(wěn)定性的影響還未有報道。本文重點考察了不同參數(shù)，即W0、緩沖液的種類、pH和離子強度、AOT濃度和溫度等對Irpex lacteus dft-1漆酶在AOT/異辛烷/水反膠束中的活性和穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明，Irpex lacteus dft-1漆酶活性隨W0的增大而提高。當(dāng)W0大于35

12、時，其活性不再有明顯的變化，而其穩(wěn)定性在較小的W0下較好。酶的最佳反應(yīng)pH為4.2，但其穩(wěn)定性隨pH的升高而增強。酶的活性和穩(wěn)定性均隨AOT濃度的提高而下降。不同的緩沖介質(zhì)，酶的活性與穩(wěn)定性不同，酶活性隨緩沖液離子強度的提高先升高而后下降，而酶在較小的離子強度下具有較好的穩(wěn)定性。酶最佳反應(yīng)溫度為50℃，但穩(wěn)定性隨溫度升高而下降。
　　 Irpex lacteus dft-1漆酶在CTAB/正己醇/異辛烷/水反膠束和Triton

13、X-100/正己醇/異辛烷/水反膠束體系中的活性明顯低于AOT/異辛烷/水反膠束中的活性，且三種反膠束體系中漆酶的活性隨W0的變化趨勢不同。另外，在CTAB和TritonX-100反膠束中漆酶的最佳反應(yīng)pH和溫度均分別為4.2和50℃，這與AOT反膠束體系中一致。另外，漆酶活性和穩(wěn)定性均隨表面活性劑濃度的提高而下降。助劑正己醇在較低濃度下對酶活性影響不大，但隨著正己醇的濃度繼續(xù)提高，酶活性明顯下降?？傮w來說，酶的穩(wěn)定性在CTAB反膠束中

14、最佳，Triton X-100次之，而在AOT反膠束體系中酶活性在初始階段下降最快。
　　 Irpex lacteus dft-1漆酶在AOT/異辛烷/水反膠束內(nèi)可以有效地催化轉(zhuǎn)化BPA，加入適量PEG400后能明顯提高BPA的轉(zhuǎn)化速率。通過考察W0、緩沖液pH和離子強度以及表面活性劑AOT濃度等多個參數(shù)對BPA的轉(zhuǎn)化速率的影響，發(fā)現(xiàn)加入PEG400后，BPA在AOT/異辛烷/水反膠束體系中的轉(zhuǎn)化速率得到了提高。PEG400是水