實(shí)驗(yàn)方案低溫乙醇法從人血清中提取免疫球蛋白

1、低溫乙醇法從人血清中提取免疫球蛋白一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康睦玫蜏匾掖挤◤娜搜逯蟹蛛x出免疫球蛋白（Ig），并獲得副產(chǎn)物血清白蛋白。二、實(shí)驗(yàn)原理（1）低溫乙醇法Cohn6法：美國哈佛大學(xué)ＥＪCOHN教授研究組，在短短兩年建立了低溫乙醇分段提取法。方法原理：往蛋白水溶液中加入中溶性有機(jī)溶劑，如乙醇、丙酮等，主要是降低水分子的活度，降低溶液的介電常數(shù)，從蛋白分子周圍排斥水分子，使蛋白分子之間通過極性基團(tuán)的相互作用，在范德華力作用下，發(fā)生凝聚。不過由于有

2、機(jī)溶劑存在，降低了蛋白分子表面憎水基團(tuán)的作用，因而引起蛋白分子聚集的主要極性基團(tuán)的相互電荷之間的引力。（文獻(xiàn)20）分離過程中，二法通過五個(gè)因素的變動(dòng)(五變系統(tǒng))，使很多血漿蛋白質(zhì)得以分離。這五個(gè)因素及其各自的作用是；①乙醇：使蛋白質(zhì)分子“脫水”；⑦pH值；蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)易于沉淀；②電解質(zhì)濃度：在低離子濃度下，對蛋白質(zhì)溶解度有較大影響；④蛋白質(zhì)濃度：濃度越低，其沉淀作用越??；⑥溫度：在低溫下，可避免乙醇對蛋白質(zhì)的變性作用。同時(shí)，蛋白質(zhì)溶

3、解為吸熱反應(yīng)，溶解度隨溫度上升而增高。經(jīng)實(shí)驗(yàn)得知，利用低溫乙醇法能將血清蛋白分成六個(gè)組分（Ⅰ~Ⅵ），其中免疫球蛋白IgG主要存在于ⅡⅢ中，白蛋白Alb主要存在于Ⅴ中。(2)Cohn氏9法；該法對Cohn氏6法的組分ⅡⅢ作進(jìn)一步分離和提純，可獲得組分Ⅱ—l，2，3(Y—G)，組分Ⅲ一1(同種凝集素)，組分Ⅲ—2(凝血酶原)，組分Ⅲ—3(血漿酶原)等產(chǎn)品。其工藝流程見圖:血清的初處理——利用Cohn6法得到組分ⅡⅢ——利用Cohn9法得到I

4、gG——IgG沉淀的保存（濃縮蛋白液或凍干品）——Ig物理性狀及生化檢定（蛋白含量、純度、免疫活性、穩(wěn)定性）4.1血清的初處理（文獻(xiàn)[4]，名詞.txt中關(guān)于血清的部分）（1）將血清從冷凍箱（5C至20℃）取出后，先置于28℃冰箱使之溶解（2）在室溫下使之全溶。以上操作注意隨時(shí)將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉淀的發(fā)生。（3）熱滅活（目的是為了去除血清中補(bǔ)體等對熱敏感的物質(zhì)，通常因?yàn)楦邷靥幚碛绊懥搜宓馁|(zhì)量，故省略）。4.2低溫乙醇

5、法提取Ig及副產(chǎn)物Alb（生物制品基礎(chǔ)摘錄4~5，文獻(xiàn)4、17）（1）量取血清體積100mL，攪拌降溫至0~4℃，將血清調(diào)pH7.2，調(diào)節(jié)NaCl濃度至0.14molL，加乙醇至8%，加入乙醇的時(shí)間控制在60~90min；從加乙醇開始起為反應(yīng)體系降溫，保持反應(yīng)溫度在2~4℃；加完乙醇后取樣測pH值，調(diào)節(jié)pH值為7.2；繼續(xù)攪拌1h，靜置30min；3000rmin離心10min，去除上清，收集沉淀并稱取質(zhì)量。（2）沉淀中加入0~4℃的注

6、射用水，加水量為沉淀質(zhì)量的7倍，持續(xù)攪拌直至成為均勻的蛋白漿；取樣測pH值，蛋白漿中加磷酸鹽緩沖液Ⅰ在5℃，調(diào)pH6.9~7.1，加0.05molLNaCl，加乙醇至25%，從加乙醇開始起為反應(yīng)體系降溫，保持反應(yīng)溫度在5℃；加完乙醇后取樣測pH值，調(diào)節(jié)pH值為6.9~7.1；繼續(xù)攪拌1h，靜置30min；3000rmin離心10min，去除上清，收集沉淀并稱取質(zhì)量，沉淀即為免疫球蛋白。（3）將上述操作所得清夜在5℃，調(diào)節(jié)pH至4.8，加

7、乙醇至40%，加后反應(yīng)30min，攪拌1h，進(jìn)行離心，離心速度小于8000rmin，取沉淀干燥，即為粗提取的副產(chǎn)物Alb。4.3Ig沉淀的保存（1）蛋白液的濃縮方法用0~4℃生理氯化鈉溶液溶解沉淀，加量為沉淀質(zhì)量的10倍，攪拌至完全溶解；取樣測pH值，蛋白溶液中加入1molLHCl，調(diào)節(jié)pH值為3.60~4.40。將聚乙二醇(PEG，即car—bowax4000W)用pH值7.2~7.4、0.01mol／L的PBS配成30％溶液，將裝有