產酶溶桿菌OH11中sigma因子的鑒定及功能研究.pdf

1、產酶溶桿菌(Lyso bacter enzymoge nes)屬于黃單胞科(Xanthomonadaceae)、溶桿菌屬(Lysobacter)，是一種重要的革蘭氏陰性生防細菌。該菌能產生多種胞外酶和小分子抗菌天然產物，對植物病原真菌及卵菌具有廣譜的抗菌活性。本實驗室以具有自主知識產權的產酶溶桿菌菌株OH11為對象，從中分離鑒定了一種結構和作用方式新穎，具有廣譜抗真菌卵菌活性的次生代謝產物HSAF(Heat Stable Antifug

2、nal Factor)。除HSAF外，菌株OH11還能利用Ⅳ菌毛(T4P)介導的蹭行運動(twitching motility，TM)在真菌菌絲上實現粘附、定殖和侵染。盡管本實驗室已闡明了產酶溶桿菌體內HSAF的生物合成途徑并鑒定了TM形成的關鍵基因，但該菌是如何調控HSAF合成和TM形成的分子機制仍不清楚。
　　Sigma(σ)因子是細菌等原核生物RNA聚合酶上的一個亞基，可以協助RNA聚合酶與模板鏈上的啟動子專一性的識別并結合

3、，極大地提高聚合酶對DNA啟動子區(qū)的結合力，從而激活或抑制基因的起始轉錄。本論文以菌株OH11為對象，旨在研究sigma因子對HSAF合成與TM形成的貢獻。
　　通過生物信息學分析，從OH11的全基因組中鑒定了28個sigma因子，其中27含有σ70結構域(RpoD)，1個含有σ54結構域(RpoN)。利用基因同源重組技術，本文構建了這27個sigma因子編碼基因的缺失突變株。通過HSAF的定量測定，我們發(fā)現這27個突變株在HSA

4、F的產量方面與野生型菌株相比均沒有形成顯著性差異。而后，在TM的檢測試驗中，我們發(fā)現RpoN參與調控了T4P介導的TM。缺失rpoN后，菌株OH11無法在菌落邊緣形成運動細胞（這是T4P介導的TM的一種指示表型）。電鏡觀察顯示，野生型OH11的細胞表面形成了多根T4P，但rpoN突變株則完全喪失這一能力。同時，在同樣的檢測條件下，其他27個突變株在其菌落邊緣均能形成清晰可見的運動細胞，表明在產酶溶桿菌中除RpoN外，其他27個sigma

5、因子不參與調控T4P介導的TM。rpoN的互補菌株恢復了形成TM以及T4P的能力，進一步從遺傳學上確認RpoN參與調控T4P介導的TM。并且我們發(fā)現RpoN在產酶溶桿菌C3菌株（一株來自美國的分離物）中也參與調控TM的形成，與OH11相似，在C3菌株中突變rpoN后，菌落邊緣將無法形成運動細胞，揭示RpoN調控TM的形成可能是不同產酶溶桿菌菌株所采用的一種保守機制。
　　PilA是已鑒定的T4P形成的主要結構蛋白，其缺失后OH11

6、完全喪失T4P以及其介導的TM。我們猜測RpoN是通過PilA來調控TM的。實時熒光定量PCR測定結果表明，在rpoN突變體中，pilA幾乎完全喪失轉錄，揭示RpoN可能是通過調控pilA的轉錄來控制TM的。與此結果相吻合，在rpoN突變體中過表達pilA后，該突變株能形成TM。進一步的細菌單雜交和EMSA（凝膠阻滯電泳）結果表明，RpoN在體外不能直接結合在pilA的啟動子區(qū)，揭示RpoN可能是通過一種間接的機制來調控pilA的轉錄。