半抗原免疫分析

1、半抗原免疫分析ABC,1,內(nèi)容,一、基本概念抗原抗體二、免疫分析方法分類ELISA原理與方法方法建立-蘇丹紅為例,2,3,抗原 antigen,Ag,4,(一)抗原的概念 抗原(Antigen,Ag) 是一類能刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答,并能與相應(yīng)的免疫應(yīng)答產(chǎn)物在體內(nèi)或體外發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì).,5,(二)完全抗原與半抗原1.完全抗原（complex antigen): 既具免疫原性又有免疫反應(yīng)

2、性的物質(zhì). 如:大多數(shù)蛋白質(zhì).2.半抗原(hapten): 僅有免疫反應(yīng)性而無免疫原性的物質(zhì).如:大多數(shù)多糖、類脂、某些藥物. 半抗原+載體(蛋白質(zhì)) 完全抗原,,6,共同抗原與交叉反應(yīng),,8,共同抗原與交叉反應(yīng) 1.共同抗原(Common antigens)： 存在于兩種不同的抗原之間的相同或相似的抗原決定簇，稱為共同抗原。 2.交叉反應(yīng)(Cross-reaction)： 由于存在共同抗原造成抗

3、體對具有相同或相似決定簇的不同抗原發(fā)生反應(yīng)，此稱為交叉反應(yīng)。 檢測意義：假陽性（避免） 多殘留檢測（利用）,,9,10,農(nóng)藥、獸藥、生物毒素、重金屬、維生素、防腐劑、植物激素等半抗原 在食品安全、植物學(xué)、環(huán)境檢測等領(lǐng)域，主要是半抗原類物質(zhì)。,抗體 antibody,Ab,抗原與抗體是天生的一對，誰也離不了誰； 兩者既是好朋友，又是一對冤家。,一、基本概念,1. 抗體（Antib

4、ody，Ab） 指B淋巴細(xì)胞受抗原刺激后活化、增殖、分化成為漿細(xì)胞，產(chǎn)生的能與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合的免疫球蛋白。 存在形式： 膜型（membrane immunoglobulin, mIg） — B細(xì)胞膜上的抗原受體； 分泌型(secreted immunoglobulin, sIg) — 分泌進(jìn)入體液, 介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答。,二、免疫球蛋白的分子結(jié)構(gòu),（一）免疫球蛋白的

5、基本結(jié)構(gòu)： 由四條多肽鏈組成，呈“Y”或“T”型 1.組成： 2條長鏈，又稱重鏈（Heavy chain，H鏈）： 含450-550aa，分子量為55-75KD。 2條短鏈，又稱輕鏈（Light chain，L鏈）： 含214aa，分子量為25KD。,,,2.分類、分型：（1）根據(jù)重鏈氨基酸組成、序列及結(jié)構(gòu)的差異，將Ig 分為五類： IgM (µ) 、

6、IgG(γ)、IgA(α)、IgD(δ)、 IgE(ε) 亞類：IgG：IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 IgA：IgA1, IgA2 IgM: IgM1, IgM2（2）分兩型： 根據(jù)輕鏈氨基酸組成、序列及結(jié)構(gòu)的差異，可將輕 鏈分為兩型：κ和λ型

7、 每一Ig單體分子兩條重鏈必須同類，兩條輕鏈必須 同型。,,,,抗體的制備方法,,3.基因工程抗體(GeAb): 第三代抗體 由基因重組技術(shù)制備的抗體,稱為基因工程抗體。 嵌合抗體 (chimeric Ab) 人源抗體（humanized Ab) 雙特異性抗體（bispecific Ab) Fab/ScFV（single chain FV fragme

8、nt) 單域抗體（single chain Ab),抗體的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，所展現(xiàn)出的生物學(xué)功能是其結(jié)構(gòu)的完美表演者。,免疫分析技術(shù),內(nèi) 容分析方法分類幾種常用免疫分析技術(shù)ELISA側(cè)流免疫層析分析方法的建立分析數(shù)據(jù)的擬合,常用的免疫標(biāo)記物質(zhì),類別 標(biāo)記物 用途熒光素 FITC、RB20

9、0、TRITC 免疫組化 鑭系元素螯合物 免疫分析測定放射性核素 3H、14C、32P、57Gr 免疫分析測定 125I、131I酶 HRP、AP 免疫組化

10、 免疫分析測定化學(xué)發(fā)光物 Luminol、lucigenin 免疫分析測定金屬顆粒 膠體金、鐵蛋白 免疫組化

11、 免疫分析測定,,,,2024/3/23,24,一、標(biāo)記免疫方法分類,1．按標(biāo)記物的種類分,(1)放射免疫分析(radioimmunoassay，RIA)(2)酶免疫分析(enzyme immunoassay，EIA)(3)化學(xué)發(fā)光酶免疫分析(chemiluminescent enzyme immunoassay，CIZIA)(4)熒光免疫分析法(fluorescence i

12、mmunoassay，F(xiàn)IA)。。。。。,,2024/3/23,25,2．按是否加入分離劑分,(1)均相免疫分析(homogeneous lmmunoassay) 在某些免疫分析中，當(dāng)抗原一抗體反應(yīng)達(dá)到平衡后，反應(yīng)液中結(jié)合的標(biāo)記藥物與游離的標(biāo)記藥物之中有一種不產(chǎn)生信號或信號消失，因此無需將反應(yīng)液分作兩相，即可在均相溶液中進(jìn)行測定，故稱為均相免疫分析。如酶放大免疫測定技術(shù)(enzyme multiplied immunoassay

13、technique，EMIT) 。(2)非均相免疫分析(heterogeneous immunoassay) 在某些免疫分析中，當(dāng)抗原一抗體反應(yīng)達(dá)到平衡后，只有在反應(yīng)液中加入分離劑，將游離標(biāo)記藥物和結(jié)合標(biāo)記藥物分開之后，才能測出各自部分的標(biāo)記藥物濃度。否則，測定的是兩者的總濃度。由于這種信號的測定需將反應(yīng)液分成液-固兩相后，才能分別測定，故稱為非均相免疫分析。如ELISA(Enzyme linked immunosorbent i

14、mmunoassay),,ELISA簡介,（一） ELISA技術(shù)的原理,間接法 夾心法 競爭法,,夾心法Sandwich,競爭法,,（二） ELISA所用試劑材料,1、固相2、酶3、底物4、緩沖液5、儀器,1、固定相,聚次亞乙烯,2024/3/23,33,2、最常用的標(biāo)記酶,1．辣根過氧化物酶(HRP):約有50％的EIA使用此酶。2．堿性磷酸酯酶(AP):AP標(biāo)記的結(jié)合物性質(zhì)穩(wěn)定，其活性可用分光

15、光度計或熒光計測量。3．6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G-6-PD): 通常用于均相EIA。4．β-半乳糖苷酶(β-Gal): 適用于均相EIA和非均相EIA。5．蘋果酸脫氫酶(MDH): 多用于尿樣的均相EIA。,3、最常用的底物,鄰苯二酚(OPC)四甲基聯(lián)苯胺(TMB),4、緩沖液,PBS(T)Tris-HClNa3N是HRP（辣根過氧化物酶）的抑制劑,酶標(biāo)儀,4、儀器,酶標(biāo)儀,（三） 免疫分析方法建立——蘇丹紅為例,Ste

16、p 1: Hapten and conjugate,Step 2: characterization of conjugate,Step 3: chessboard tiatrion and calibration curve,,Step 4: optimization—nonessential,,例1、標(biāo)記抗原濃度對檢測的影響,43,例，pH影響,Step 5: sample analysis,Step 6: validation,,