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文檔簡介
1、高效液相色譜高效液相色譜法系采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動相泵入裝有填充劑的色譜柱,對供試品進行分離測定的色譜方法。注入的供試品,由流動相帶入柱內,各組分在柱內被分離,并依次進入檢測器,由積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄和處理色譜信號。1、對儀器的一般要求和色譜條件對儀器的一般要求和色譜條件所用的儀器為高效液相色譜儀。儀器應定期檢定并符合有關規(guī)定。(1)色譜柱色譜柱反相色譜系統(tǒng)使用非極性添充劑,常用的色譜柱填充劑為化學鍵合硅膠,以十八烷基硅烷鍵合硅
2、膠最為常用,辛基硅烷鍵合硅膠和其他類型的硅烷鍵合硅膠(如氰基鍵合硅烷和氨基鍵合硅烷等)也有使用。正相色譜系統(tǒng)使用極性填充劑,常用的填充劑有硅膠等。離子交換色譜使用離子交換填充劑;分子排阻色譜使用凝膠或高分子多孔微球等填充劑;對映異構體的分離通常使用手性填充劑。填充劑的性能(如載體的形狀、粒徑、孔徑、表面積、鍵合基團的表面覆蓋度、含碳量和鍵合類型等)以及色譜柱的填充,直接影響供試品的保留行為和分離效果。分析分子量小于2000的化合物應選擇
3、孔徑在15nm(1nm=10)以下的填料,分析分子量大于2000的化合物則應選擇孔徑在30nm以上的填料。.除另有規(guī)定外,普通分析柱的填充劑粒徑一般在3~10μm之間,粒徑更?。s2μm)的填充劑常用于填裝微徑柱(內徑約2mm)。使用微徑柱時,輸液泵的性能、進樣體積、檢測池體積和系統(tǒng)的死體積等必須與之匹配;如有必要,色譜條件也需作適當?shù)恼{整。當對其測定的結果產生爭議時,應以品種項下規(guī)定的色譜條件的測定結果為準。以硅膠為載體的鍵合固定相的
4、使用溫度通常不超過40℃,為改善分離效果可適當提高色譜柱的使用溫度,但不宜超過60℃。流動相的PH值應控制在2~8之間。當pH大于8時,可使載體硅膠溶解;當pH小于2時,與硅膠相連的化學鍵合相易水解脫落。當色譜系統(tǒng)中需使用PH大于8的流動相時,應選用耐堿的填充劑,如采用高純硅膠為載體并具有高表面覆蓋度的鍵合硅膠填充劑、包覆聚合物填充劑、有機無機雜化填充劑或非超過10%為限,如30%相對改變量的數(shù)值超過總量的10%時,則改變量以總量的10
5、%為限。對于必須使用特定牌號的填充劑方能滿足分離要求的品種,可在該品種項下注明。2、系統(tǒng)適用性試驗系統(tǒng)適用性試驗色譜系統(tǒng)的適用性試驗通常包括理論板數(shù)、分離度、重復性和拖尾因子等四個參數(shù)。其中,分離度和重復性尤為重要。按各品種項下要求對色譜系統(tǒng)進行適用性試驗,即用規(guī)定的對照品溶液或系統(tǒng)適用性試驗溶液在規(guī)定的色譜系統(tǒng)進行試驗,必要時,可對色譜系統(tǒng)進行調整,以符合要求。(1)色譜柱的理論板數(shù)色譜柱的理論板數(shù)(n)用于評價色譜柱的分離效能。由于
6、不同物質在同一色譜柱上的色譜行為不同,采用理論板數(shù)作為衡量柱效能的指標時,應指明測定物質,一般為待測組分或內標物質的理論板數(shù)。在規(guī)定的條件下,注入供試品溶液或各品種項下規(guī)定的內標物質溶液,記錄色譜圖,量出供試品主成分峰或內標物質峰的保留時間tR(以分鐘或長度計,下同,但應取相同單位)和峰寬(W)半峰高寬(Wh2),按n=16(tRW)2或5.54(tRWh2)2計算色譜柱的理論板數(shù)。(2)分離度()分離度(R)用于評價待測組分與相鄰共存
7、物或難分離物質之間的分離程度,是衡量色譜系統(tǒng)效能的關鍵指標??梢酝ㄟ^測定待測物質與已知雜質的分離度,也可以通過測定待測組分與某一添加的指標性成分(內標物質或其他難分離物質)的分離度,或將供試品或對照品用適當?shù)姆椒ń到?,通過測定待測組分與某一降解產物的分離度,對色譜系統(tǒng)進行評價與控制。無論是定性鑒別還是定量分析,均要求待測峰與其他峰、內標峰或特定的雜質對照峰之間有較好的分離度。除另有規(guī)定外,待測組分與相鄰共存物之間的分離度應大于1.5。分
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