1摘要核桃系胡桃科核桃屬植物

1、克隆平末端的目的片段時(shí)，為最大量地獲得“正確”的連接產(chǎn)物，載體和目的DNA在連接反應(yīng)中的比例必須適當(dāng)。載體與目的DNA的摩爾比過(guò)高，會(huì)造成大量的環(huán)化空質(zhì)粒，既可能是單一質(zhì)粒的環(huán)化，也可能是多個(gè)質(zhì)粒聚集而形成的環(huán)化。摩爾比如果過(guò)低，則會(huì)產(chǎn)生過(guò)量的在大小、方向和組成上各不相同的線狀和環(huán)狀的均質(zhì)或異質(zhì)性多聚體。為此，每一重組體中外源DNA的連接方向和插入數(shù)量都必須用限制酶酶切圖譜分析或其他方法加以鑒定。本實(shí)驗(yàn)以載體與目的片段的摩爾比為1:10

2、進(jìn)行連接，同時(shí)應(yīng)用三種不同的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行多重鑒定，取得了滿意的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。連接體系中高濃度的平端，也是獲得平端連接的必要條件。在載體和目的片段的摩爾比適當(dāng)?shù)臈l件下，盡量加大各自的摩爾濃度，以縮小載體片段末端與目的片段末端在空間上的距離，從而加大二者的碰撞幾率，減小載體片段的自身環(huán)化連接。本實(shí)驗(yàn)主要從以下幾點(diǎn)來(lái)加大連接體系中載體片段和目的片段的平端濃度：1）提取質(zhì)粒DNA時(shí)盡量做到高濃度、高質(zhì)量；2）酶切時(shí)，在不影響酶切效果的情況下，加

3、大酶切體系中質(zhì)粒DNA的濃度；3）凝膠電泳分離目的DNA時(shí)，加入大量酶切產(chǎn)物，膠回收時(shí)盡量少帶膠，切下的膠中目的片段的濃度盡量高，從而使回收的溶液中DNA片段的濃度盡量高；4）連接體系盡可能?。ㄒ话?~10μl），體系中除T4噬菌體DNA連接酶和相應(yīng)的緩沖液外，全部由兩種膠回收溶液按特定比例填充。低濃度（0.5mmolL）的ATP和極高濃度的連接酶也是平端連接的必要條件。在反應(yīng)混合物中，ATP作為10連接緩沖液的組分，給載體和外源DNA

4、片段提供了更為廣闊的空間。本實(shí)驗(yàn)中廠家提供的連接緩沖液含有ATP，因而沒(méi)有另外加入ATP。此外，平端連接是低效反應(yīng)，連接反應(yīng)的時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，所以應(yīng)加入極高濃度的連接酶。去除載體5’端的磷酸基可防止質(zhì)粒DNA的自身環(huán)化，這一點(diǎn)在不少書籍中提到。但對(duì)于去磷酸化處理是否有利，各家的觀點(diǎn)不盡相同，有很多研究者對(duì)去磷酸化的作用持有疑問(wèn)。毫無(wú)疑問(wèn)，去除5’端的磷酸基可抑制質(zhì)粒DNA的自身環(huán)化，因而降低帶有“空”質(zhì)粒的細(xì)菌克隆所產(chǎn)生的背景。因而，也會(huì)

5、經(jīng)常發(fā)生同時(shí)使帶有重組質(zhì)粒的克隆減少的情況。此外，去磷酸后，必須對(duì)堿性磷酸酶進(jìn)行充分滅活，以保證下一步的連接反應(yīng)順利進(jìn)行，但滅活過(guò)程中進(jìn)行抽提時(shí)，大大降低了質(zhì)粒DNA的濃度，不容易操作。本實(shí)驗(yàn)初期嘗試應(yīng)用堿性磷酸酶去除載體5’端的磷酸基，效果并不理想。鑒于這些原因，本實(shí)驗(yàn)不推薦使用這一方法。在連接反應(yīng)混合物加入一些可促進(jìn)大分子群聚作用并可導(dǎo)致DNA分子凝聚成聚集體的物質(zhì)，如聚乙二醇或氯化六合高鈷，可以使如何取得適當(dāng)濃度的平端DNA問(wèn)題迎

6、刃而解。但考慮到這些物質(zhì)的加入也增強(qiáng)了連接產(chǎn)物的硬度，大大降低了連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌的效率，所以本實(shí)驗(yàn)并沒(méi)有應(yīng)用這類物質(zhì)。1摘要核桃系胡桃科核桃屬植物，在我國(guó)分布范圍廣闊。本文首先以普通核桃的不同部分為研究對(duì)象，確定各部分多酚類物質(zhì)的組成及含量的分布；再以普通核桃、不老屯核桃、美國(guó)黑核桃為試驗(yàn)材料，重點(diǎn)研究不同品種核桃青皮中多酚類物質(zhì)的成分、含量及抗氧化活性。試驗(yàn)結(jié)果表明：核桃中對(duì)人體有益的多酚類物質(zhì)主要集中在青皮、種皮部分，且青皮中多

7、酚類物質(zhì)的絕對(duì)含量相對(duì)較高；在不同品種核桃青皮的多酚類物質(zhì)中，從總酚含量、單寧含量及胡桃醌含量看，美國(guó)黑核桃青皮均最高，其次為普通核桃青皮，不老屯核桃青皮均最少。從所擁有的多酚類物質(zhì)種類數(shù)看，普通核桃青皮的最多，其次為美國(guó)黑核桃青皮，不老屯核桃青皮最少。在三個(gè)品種的酚酸類物質(zhì)中，沒(méi)食子酸含量均是最高的，且從其含量看，不老屯核桃青皮最高，其次為美國(guó)黑核桃青皮，普通核桃青皮最少。在三個(gè)品種的黃酮類物質(zhì)中，蘆丁的含量均是最高的，且從其含量上看

8、，美國(guó)黑核桃青皮最高，其次為普通核桃青皮，不老屯核桃青皮最少。從抗氧化性看，利用DPPH自由基的反應(yīng)體系進(jìn)行清除自由基實(shí)驗(yàn)，美國(guó)黑核桃青皮清除自由基的能力最強(qiáng)，其次為不老屯核桃青皮，..............................................................................123.1.1核桃果實(shí)不同部位的多酚類物質(zhì)的提取...........................

9、..............123.1.2不同核桃青皮中多酚類物質(zhì)的提取.................................................123.2核桃多酚類物質(zhì)的顯色反應(yīng)................................................................123.3核桃總酚的測(cè)定—普魯士藍(lán)法....................................

10、........................123.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作................................................................................123.3.2樣品的測(cè)定........................................................................................13

11、3.4核桃單寧的測(cè)定:蛋白質(zhì)沉淀法..........................................................133.5核桃PPC的測(cè)定..................................................................................143.5.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備....................................

12、............................................1443.5.2PPC（沉淀蛋白質(zhì)的量樣品重量）的測(cè)定....................................143.6核桃青皮中多酚類物質(zhì)的組成的HPLC色譜測(cè)定...........................153.6.1酚酸類.................................................

13、..............................................153.6.2黃酮類...............................................................................................153.7核桃青皮中總黃酮的測(cè)定.....................................................

14、..............153.7.1定性實(shí)驗(yàn)－紫外吸收光譜...............................................................153.7.2顏色反應(yīng)...........................................................................................163.7.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作.........

15、......................................................................163.7.4樣品的測(cè)定.......................................................................................163.8不同核桃青皮葉綠素含量的測(cè)定................................

16、......................173.9不同核桃青皮胡桃醌的測(cè)定...............................................................173.10不同核桃青皮抗氧化活性的測(cè)定......................................................174結(jié)果與分析....................................

17、..............................................................184.1核桃果實(shí)不同部位的多酚類物質(zhì)分析比較......................................184.1.1核桃果實(shí)不同部位的多酚類物質(zhì)的顯色反應(yīng)結(jié)果........................184.1.2核桃果實(shí)不同部位的多酚類物質(zhì)的組成及HPLC分析比較.........194

18、.2不同核桃青皮中多酚類物質(zhì)分析比較...............................................234.2.1不同核桃青皮中多酚類物質(zhì)的顯色反應(yīng)結(jié)果................................234.2.2不同核桃青皮中有關(guān)指標(biāo)的分析比較............................................234.2.3不同核桃青皮的多酚類物質(zhì)的組成比較及HPLC分

19、析比較.........244.2.4不同核桃青皮的黃酮類物質(zhì)的顯色反應(yīng)結(jié)果...............................254.2.5不同核桃青皮中總黃酮的測(cè)定.....................................................254.2.6不同核桃青皮中胡桃醌的測(cè)定.......................................................264

20、.3不同核桃青皮酚類物質(zhì)的抗氧化活性研究.......................................295討論.............................................................................................................306結(jié)論..........................................

21、...................................................................316.1核桃果實(shí)不同部位的多酚類物質(zhì)分析比較.......................................316.2不同核桃青皮的多酚類物質(zhì)分析比較...............................................316.3不同核桃青皮的酚類物質(zhì)的抗氧化活性比

22、較...................................3111引言1.1核桃的概況1.1.1核桃的種類及分布核桃（JuglansregiaL）系被子植物門雙子葉植物綱胡桃科（Juglanceae）核桃屬植物，原產(chǎn)于歐洲東南部、東亞及北美地區(qū)，是人類種植最古老的樹(shù)生堅(jiān)果之一[13]。核桃屬（JuglansL）植物分為三個(gè)組，核桃組（Sect.Julans）、核桃楸組(Sect.cardiocaryonDode)、黑核桃組