第一章 蛋白質(zhì)化學(xué)3 結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系

1、主講教師：　季祥　郵箱：jixiang@imust.cn,第一章 蛋白質(zhì)化學(xué),§1.4 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能,§1.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,§1.5 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì),§1.6 蛋白質(zhì)的分離、純化與測定,§1.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,一、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,⒈一級結(jié)構(gòu)是空間構(gòu)象的基礎(chǔ),RNase是由124氨基酸殘基組成的單肽鏈，分子中 8 個(gè)Cys的-SH構(gòu)成4對二硫鍵

2、，形成具有一定空間構(gòu)象的蛋白質(zhì)分子。在蛋白質(zhì)變性劑（如8mol/L的尿素）和一些還原劑（如巰基乙醇）存在下，酶分子中的二硫鍵全部被還原，酶的空間結(jié)構(gòu)破壞，肽鏈完全伸展，酶的催化活性完全喪失。當(dāng)用透析的方法除去變性劑和巰基乙醇后，發(fā)現(xiàn)酶大部分活性恢復(fù)，所有的二硫鍵準(zhǔn)確無誤地恢復(fù)原來狀態(tài)。若用其他的方法改變分子中二硫鍵的配對方式，酶完全喪失活性。這個(gè)實(shí)驗(yàn)表明，蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)決定它的空間結(jié)構(gòu)，而特定的空間結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)具有生物活性的保證。如下

3、圖：,§1.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,,§1.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,2. 前體與活性蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的關(guān)系,由108個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的前胰島素原(pre-proinsulin），在合成的時(shí)候完全沒有活性，當(dāng)切去N-端的24個(gè)氨基酸信號肽，形成84個(gè)氨基酸的胰島素原（proinsulin），胰島素原也沒活性，在包裝分泌時(shí)，A、B鏈之間的33個(gè)氨基酸殘基被切除，才形成具有活性的胰島素。如圖所示:,,§

4、1.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,,,胰島素：AB兩條鏈構(gòu)成，A鏈含21個(gè)氨基酸殘基，B鏈含 30 個(gè)氨基酸殘基，鏈間有兩對二硫鍵，A鏈上有一對二硫鍵。,§1.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,3.同源蛋白質(zhì)有順序同源性： 比較不同來源的細(xì)胞色素C發(fā)現(xiàn)，與功能密切相關(guān)的氨基酸殘基是高度保守的，這說明不同種屬具有同一功能的蛋白質(zhì)，在進(jìn)化上來自相同的祖先，但存在種屬差異。不同種屬間的同源蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)上相對應(yīng)

5、的氨基酸差別越大，其親緣關(guān)系愈遠(yuǎn)，反之，其親緣關(guān)系愈近。,§1.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,血紅蛋白的亞基與肌紅蛋白一級結(jié)構(gòu)中的保守氨基酸殘基,§1.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,⒋ 蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)與分子病,現(xiàn)知幾乎所有遺傳病都與蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)改變有關(guān)，都稱之為分子病。例如鐮刀型貧血癥，它是由于血紅蛋白的β-亞基上的第六位氨基酸由谷氨酸變成了纈氨酸，導(dǎo)致血紅蛋白的結(jié)構(gòu)和功能的改變，其運(yùn)輸氧氣的能力大大地降低，并且

6、紅細(xì)胞呈鐮刀狀。,§1.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,§1.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,§1.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,,§1.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,所以，蛋白質(zhì)一定的結(jié)構(gòu)執(zhí)行一定的功能。功能不同的蛋白質(zhì)總是有著不同的序列；比較種屬來源不同而功能相同的蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)，可能有某些差異，但與功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)也總是相同。若一級結(jié)構(gòu)變化，蛋白質(zhì)的功能可能發(fā)生很大的變化。,§1.4

7、 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,二、蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,（一）肌紅蛋白（Mb）與血紅蛋白的結(jié)構(gòu)與功能：,,§1.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,肌紅蛋白的結(jié)構(gòu),§1.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,§1.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,肌紅蛋白的亞基鐵卟啉,§1.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,§1.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,肌紅蛋白的氧合曲線,§1.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)

8、系,§1.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,,§1.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,Hb由4條肽鏈組成：2α、2β，功能是運(yùn)載O2 。在去氧Hb亞基中有下列幾對離子鍵：,§1.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,§1.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,§1.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,由于血紅蛋白亞基之間存在大量離子鍵，使其構(gòu)象呈緊張態(tài)，對氧的親和力很低，第一個(gè)亞基與O2結(jié)合時(shí)，離子鍵的破壞較難，所需

9、要的能量較多。當(dāng)血紅蛋白的一個(gè)亞基結(jié)合氧之后引起它的構(gòu)象從緊張態(tài)變成松弛態(tài)，其它的離子鍵也依次破壞，此時(shí)破壞離子鍵所需要的能量也少，構(gòu)象的變化導(dǎo)致血紅蛋白對氧的親和力大大增強(qiáng)，因此第四個(gè)亞基結(jié)合氧的能力比第一個(gè)大幾百倍。,§1.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,§1.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,§1.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,§1.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,上述Hb與O2結(jié)合后，Hb的構(gòu)象發(fā)

10、生變化，這類變化稱為變構(gòu)效應(yīng)，即通過構(gòu)象變化影響蛋白質(zhì)的功能。像血紅蛋白這種具有變構(gòu)效應(yīng)的蛋白質(zhì)稱為變構(gòu)蛋白（allosteric protein）。血紅蛋白的這種變構(gòu)效應(yīng)能更有效地行使其運(yùn)氧的生物學(xué)功能。,§1.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,血紅蛋白的變構(gòu)效應(yīng)使其有利于氧的運(yùn)輸,§1.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,,二磷酸甘油酸（BPG）結(jié)合于四個(gè)亞基的中央空穴處,§1.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,二磷

11、酸甘油酸（BPG）降低血紅蛋白對氧的親和力,§1.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,波爾（Bohr）效應(yīng)有利于血紅蛋白對氧的運(yùn)輸,§1.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,由于基因水平的突變導(dǎo)致的血紅蛋白的分子病,§1.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,（二）免疫系統(tǒng)與免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)與功能,§1.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,§1.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,§1.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能

12、的關(guān)系,§1.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,§1.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,§1.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,§1.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,免疫球蛋白的結(jié)構(gòu),§1.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,§1.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,§1.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,§1.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,§1.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,

13、§1.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,§1.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,§1.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,§1.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,§1.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,§1.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,總之，各種蛋白質(zhì)都有特定的空間構(gòu)象，而特定的空間構(gòu)象又與它們特定的生物學(xué)功能相適應(yīng)，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能是高度統(tǒng)一的。,§1.5 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì),一、

14、蛋白質(zhì)的兩性電離和等電點(diǎn),蛋白質(zhì)與氨基酸相似，也具有兩性電離的性質(zhì)。蛋白質(zhì)的多肽鏈含有末端氨基和羧基，一些側(cè)鏈上含有可解離的基團(tuán)，有的可以接受氫離子，有的可以電離出氫離子，因此蛋白質(zhì)具有酸堿兩性電離的性質(zhì)。它的兩性電離比氨基酸復(fù)雜。 對某一蛋白質(zhì)而言，在某一pH下，當(dāng)它所帶正負(fù)電荷相等的時(shí)候，該溶液的pH就稱為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。 蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)的大小與蛋白質(zhì)的氨基酸組成有關(guān)。,§1.5 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及分離純化,

15、二、蛋白質(zhì)的高分子性質(zhì),蛋白質(zhì)溶液有許多高分子溶液的性質(zhì)，如：擴(kuò)散慢、易沉降、 粘度大、不能透過半透膜，在水溶液中可形成親水的膠體。    蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定因素：水化膜、帶電荷。當(dāng)破壞這兩個(gè)因素時(shí)，蛋白質(zhì)中從溶液中析出而產(chǎn)生沉淀。,§1.5 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及分離純化,三、蛋白質(zhì)的沉淀作用,使蛋白質(zhì)從溶液中析出的現(xiàn)象稱為沉淀，方法有：,1. 鹽析：在蛋白質(zhì)的水溶液中，加入大量高

16、濃度的強(qiáng)電解質(zhì)鹽如硫酸胺、氯化鈉、硫酸鈉等，使蛋白質(zhì)從溶液中析出，稱為蛋白質(zhì)的鹽析。而低濃度的鹽溶液加入蛋白質(zhì)溶液中，會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的溶解度增加，該現(xiàn)象稱為鹽溶。 鹽析的機(jī)理：破壞蛋白質(zhì)的水化膜，中和表面的凈電荷。 鹽析法是最常用的蛋白質(zhì)沉淀方法，該方法不會(huì)使蛋白質(zhì)產(chǎn)生變性。,§1.5 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及分離純化,2.有機(jī)溶劑沉淀法：在蛋白質(zhì)溶液中，加入能與水互溶的有機(jī)溶劑如乙醇、丙酮等，蛋白質(zhì)產(chǎn)生沉淀。

17、 有機(jī)溶劑沉淀法的機(jī)理：破壞蛋白質(zhì)的水化膜。 有機(jī)溶液沉淀蛋白質(zhì)通常在低溫條件下進(jìn)行，否則有機(jī)溶劑與水互溶產(chǎn)生的溶解熱會(huì)使蛋白質(zhì)產(chǎn)生變性。,3.重金屬鹽沉淀（條件：pH 稍大于pI為宜）：在蛋白質(zhì)溶液中加入重金屬鹽溶液，會(huì)使蛋白質(zhì)沉淀。 重金屬沉淀法的機(jī)理：重金屬鹽加入之后，與帶負(fù)電的羧基結(jié)合。 重金屬沉淀蛋白質(zhì)會(huì)使蛋白質(zhì)產(chǎn)生變性，長期從事重金屬作業(yè)的人應(yīng)多吃高蛋白食品，以防止重金屬離子被機(jī)體吸收后造成對機(jī)體的損害。,&#

18、167;1.5 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及分離純化,4.生物堿試劑沉淀法（條件：pH稍小于pI）生物堿是植物組織中具有顯著生理作用的一類含氮的堿性物質(zhì)。能夠沉淀生物堿的試劑稱為生物堿試劑。生物堿試劑一般為弱酸性物質(zhì)，如單寧酸、苦味酸、三氯乙酸等。生物堿試劑沉淀蛋白質(zhì)的機(jī)理：在酸性條件下，蛋白質(zhì)帶正電，可以與生物堿試劑的酸根離子結(jié)合而產(chǎn)生沉淀。 “柿石癥”的產(chǎn)生就是由于空腹吃了大量的柿子，柿子中含有大量的單寧酸，使腸胃中的蛋白質(zhì)凝固變性

19、而成為不能被消化的“柿石”。,5.弱酸或弱堿沉淀法：用弱酸或弱堿調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)溶液的pH處于等電點(diǎn)處，使蛋白質(zhì)沉淀。 弱酸或弱堿沉淀法機(jī)理：破壞蛋白質(zhì)表面凈電荷。,§1.5 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及分離純化,四、蛋白質(zhì)的變性作用、結(jié)絮和凝固,1.蛋白質(zhì)變性的概念：天然蛋白質(zhì)受物理或化學(xué)因素的影響后，使其失去原有的生物活性，并伴隨著物理化學(xué)性質(zhì)的改變，這種作用稱為蛋白質(zhì)的變性。,2.使蛋白質(zhì)變性的因素1）物理因素：高溫、高壓、射

20、線等 2）化學(xué)因素：強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、重金屬鹽等,3.變性的本質(zhì)： 分子中各種次級鍵斷裂，使其空間構(gòu)象從緊密有序的 狀態(tài)變成松散無序的狀態(tài)，一級結(jié)構(gòu)不破壞。,§1.5 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及分離純化,4.蛋白質(zhì)變性后的表現(xiàn)：1）生物學(xué)活性消失2）理化性質(zhì)改變：溶解度下降，粘度增加，紫外吸收增 加，側(cè)鏈反應(yīng)增強(qiáng)，對酶的作用敏感，易被水解。,五、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng),蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)主要與其定性、定量測定有關(guān)： 1.茚三

21、酮反應(yīng)：多肽與蛋白質(zhì)都能與之反應(yīng)生成藍(lán)色化合物。2.雙縮脲反應(yīng)：多肽與蛋白質(zhì)都能和雙縮脲試劑反應(yīng)，隨著肽 鍵的數(shù)目越多，顏色依次為粉紅、紫紅、紫、藍(lán)。3.酚試劑反應(yīng)：多肽與蛋白質(zhì)與酚試劑生成藍(lán)色的化合物。 另外，前面提到的氨基酸顏色反應(yīng)蛋白質(zhì)都具有。,六、蛋白質(zhì)的紫外吸收特征,蛋白質(zhì)溶液能在近紫外區(qū)（280nm處）有光吸收，主要是由帶芳香環(huán)的氨基酸決定的。其對紫外光吸收能力的強(qiáng)弱順序?yàn)椋?色（Trp）>酪（Tyr

22、）>苯丙（Phe）。,§1.6 蛋白質(zhì)的分離、純化與測定,一、分離純化蛋白質(zhì)的意義,研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能：要求純度高，不變性； 提取活性的酶或蛋白質(zhì)：必須保持天然活性狀態(tài)； 作為藥物或食品添加劑：純度要求一般。,二、蛋白質(zhì)分離純化的一般步驟,材料的選擇→原料的預(yù)處理→蛋白質(zhì)的抽提→從抽提液中沉淀蛋白質(zhì)→純化→蛋白質(zhì)的結(jié)晶,§1.6 蛋白質(zhì)的分離、純化與測定,1.原料的選擇：要求含待分離的蛋白質(zhì)豐富，廉

23、價(jià)，易得，容易收集，新鮮無腐敗。2.原料的預(yù)處理：如果待分離蛋白質(zhì)為胞外蛋白質(zhì)，材料破碎后，用適當(dāng)?shù)娜軇┲苯映樘?；若待分離蛋白質(zhì)為胞內(nèi)蛋白質(zhì)，則需要破碎細(xì)胞膜，再用適當(dāng)?shù)娜軇┏樘帷?.從抽提液中沉淀蛋白質(zhì)：常用鹽析法、低溫乙醇沉淀法、等電點(diǎn)沉淀法。,§1.6 蛋白質(zhì)的分離、純化與測定,4. 純化：將沉淀的蛋白質(zhì)溶解，再選擇適當(dāng)?shù)募兓椒?，得到純度比較高的蛋白質(zhì)溶液。純化方法：透析或超濾、電泳法、凝膠過濾法、離子交換層析

24、、吸附層析法、超速離心法等。5. 蛋白質(zhì)的結(jié)晶：從溶液中重新沉淀蛋白質(zhì)。,幾種常見的純化蛋白質(zhì)的方法如下圖所示：,§1.6 蛋白質(zhì)的分離、純化與測定,,凝膠電泳法：,§1.6 蛋白質(zhì)的分離、純化與測定,,離子交換層析 ：,§1.6 蛋白質(zhì)的分離、純化與測定,,,凝膠過濾層析：,§1.6 蛋白質(zhì)的分離、純化與測定,,親和層析：,§1.4 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能,§1.4 蛋