病毒載體研究進(jìn)展

1、病毒載體概述（1）,要求：1、攜帶外源基因并能包裝成感染性病毒顆粒 2、介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)移和表達(dá) 3、對(duì)機(jī)體不致病,容量：自身基因組大小的105%~110%,組成：1、病毒復(fù)制和包裝元件 2、病毒基因 3、插入的外源基因或元件 4、病毒外殼/外膜,用途：基因轉(zhuǎn)移和表達(dá) 1、基因治療

2、 2、疫苗 3、器官移植 4、組織工程 5、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 6、基因功能研究,病毒載體概述（2）,優(yōu)點(diǎn)：1、利用病毒天然的感染性進(jìn)入細(xì)胞，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高；

3、 2、復(fù)雜的裝配過程由細(xì)胞完成； 3、不同的病毒載體具有不同的表達(dá)特點(diǎn)。,常用的病毒載體的特點(diǎn)：,病毒載體研究方向,1、病毒包裝系統(tǒng),,2、無病毒基因的病毒載體,6、自我擴(kuò)增型病毒載體,7、條件增殖型病毒載體,5、嵌合型病毒載體,3、靶向性病毒載體,4、可調(diào)控表達(dá)的病毒載體,8、新病毒載體,病毒載體包裝系統(tǒng),,組成：1、宿主細(xì)胞 2、輔助元件（輔助質(zhì)粒、輔助病毒）

4、 3、被包裝的DNA/RNA 包含順式作用元件,單因素生產(chǎn)系統(tǒng)（one-component system),雙因素生產(chǎn)系統(tǒng) (two-component system),,gag pol env,,,,,,,,,圖1 反轉(zhuǎn)錄病毒包裝系統(tǒng)示意圖,圖2 腺病毒包裝系統(tǒng)示意圖,293 cell,,E1a,b,,,,,,,,,,,,,,,JM17,,,Ad Shuttle,293 cell,,E

5、1a,b,,,,,多因素生產(chǎn)系統(tǒng) (multi-component system),,圖3 腺病毒伴隨病毒包裝系統(tǒng)示意圖,,,,Host cell +vector DNA,Helper virus +helper plasmid,圖4 雙因素系統(tǒng)生產(chǎn)重組AAV病毒示意圖,proviral cell,Recombinant helper virus(rHSV-repcap),,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,無病

6、毒基因的病毒載體,,被包裝的DNA/RNA中不含任何病毒編碼基因，只保留其復(fù)制和包裝所必需的順式作用元件。獲得的重組病毒顆粒具有野生型病毒的外殼/外膜和感染性，但不表達(dá)病毒蛋白。,腺伴隨病毒載體：,反轉(zhuǎn)錄病毒載體：,腺病毒載體：,單純皰疹病毒載體：,,,,,,gene,ITR,ITR,,pA,,無輔助病毒包裝系統(tǒng),,圖5 重組AAV無輔毒包裝系統(tǒng),,,Adenovirus with packaging signal flanke

7、d by loxP,,,,,,,,,,,,,,圖6 mini-adnovirus無輔毒包裝系統(tǒng),靶向性病毒載體,,轉(zhuǎn)導(dǎo)靶向性,轉(zhuǎn)錄靶向性（特異性）,改造病毒外殼/外膜,連接靶向性結(jié)合分子,,Modified adenovirus,,,,,,,cell,,,,,組織特異性啟動(dòng)子,腫瘤選擇性啟動(dòng)子,細(xì)胞周期調(diào)控啟動(dòng)子,腫瘤血管內(nèi)皮導(dǎo)向啟動(dòng)子,雙特異性啟動(dòng)子,,,,,病毒增殖的特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控,可調(diào)控表達(dá)的病毒載體,,細(xì)胞的調(diào)控元件,病毒的調(diào)

8、控元件,人工合成的調(diào)控元件,,,,,細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄,,細(xì)胞啟動(dòng)子 病毒啟動(dòng)子albumin MVM P4Tyrosinase or TRP-1 B19 promoterPSA HBVMBP JCV MCK

9、 EBVGFAP NSE KDR/flt-1AFPCEAerbB2HREMDR1,,四環(huán)素調(diào)控,合成的轉(zhuǎn)錄因子,,,,,FKB12,ZFHD-1,FRAP,P65,,,rapamycin,RU486,,Diphenol indene,,,,muristerone,重組病毒的生產(chǎn)和純化,小量制備和

10、純化,大量制備和純化,,,,,,場(chǎng)所細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞裂解病毒分離病毒純化制劑保存,培養(yǎng)瓶 轉(zhuǎn)瓶、細(xì)胞工廠、發(fā)酵罐,反復(fù)凍融 機(jī)械法或化學(xué)法裂解,實(shí)驗(yàn)室 中試車間,離心

11、 離心、超濾、萃取,密度梯度超速離心 濃縮、柱層析,配方,緩沖液,低溫,,病毒載體與基因治療產(chǎn)業(yè)化,,基因治療產(chǎn)品的知識(shí)產(chǎn)權(quán)構(gòu)成 1、治療基因2、調(diào)控元件3、改造的外殼/外膜4、靶向分子5、包裝系統(tǒng)6、生產(chǎn)和純化技術(shù)7、制劑和保存技術(shù),產(chǎn)業(yè)化的組織和實(shí)施：