免疫學檢測中的曲線擬合

1、免疫測定中的數(shù)據(jù)處理與曲線擬合,免疫測定中的數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)處理與科學作圖,,免疫測定中的數(shù)據(jù)處理與曲線擬合,免疫測定的數(shù)據(jù)處理及結(jié)果報告,臨床免疫檢測技術(shù)：RIA和EIA等；數(shù)據(jù)處理的意義和目標：只有在測定結(jié)果以一種有意義的方式報告時，測定結(jié)果才有用；免疫測定結(jié)果的客觀評價，對改善免疫測定的重復性以及免疫測定的標準化都有重要意義。數(shù)據(jù)處理報告的要求：通俗易懂；定性結(jié)果明確，定量范圍明確；處理后得到的數(shù)據(jù)要具有可重復性；

2、試驗的評價不能建立在假定的正態(tài)分布上；結(jié)果具有用于進一步分析處理（如流行病學）的充分性。免疫測定以其測定結(jié)果的表達方式：定性，定量兩類。,定性測定--- “有” 或“無”,判定結(jié)果：陰性，陽性。判定依據(jù)：cut-off值，S/N or P/N比值。判斷依據(jù)確立原則：盡可能避免假陽性和假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。應用：傳染性病原體的血清標志物檢測。,定性測定數(shù)據(jù)處理 --cut-off值的確定,相關(guān)概念： ELISA測定的“灰區(qū)”---

3、 陽性判斷值的確定就是要使以其得到的測定結(jié)果的假陽性和假陰性的發(fā)生率最低，處于陽性判斷值定值域中的測定結(jié)果可歸為可疑，亦即ELISA測定的“灰區(qū)”。,定性測定數(shù)據(jù)處理 --cut-off值的確定,Cut-off 值設定的一般方法：標準差比率 standard deviation ratio, SDR測定標本對陰性比值（P/N or S/N） test to negative ratio, TNR以陰性對照均值+2或3SD作為

4、cut-off值綜合陰性對照均值+2或3SD及陽性對照-2或3SD建立cut-off值綜合陰性對照均值+2或3SD及陽性對照-2或3SD和轉(zhuǎn)化血清結(jié)果建立cutoff值百分位數(shù)法相對單位（relative units, EIU): 標本EIU=雙質(zhì)控（double control，2C）：0.18X（陰性質(zhì)控物中值+陽性質(zhì)控物中值）使用ROC曲線設定cut-off值,使用ROC曲線設定cut-off 值：,ROC曲線：橫坐標

5、為假陽性率FPR=[假陽性數(shù)/（假陽性+真陰性）] 縱坐標為真陽性率TPR=[真陽性數(shù)/（真陽性+假陰性）],根據(jù)這種關(guān)系確定區(qū)分正常與異常的分界點究竟在何處最合適，也就是說此時的假陽性和假陰性率最低或比例最適當或最為符合使用目的，該分界點即可作為ELISA cut-off值。,ROC曲線的含義：,陽性人群的測定值與陰性人群的測定值重疊程度越小，即測定的識別能力越高，ROC曲線越偏向上，曲線下面積越大。,定量測定

6、---測定待測物的含量,判定結(jié)果：濃度（U/L，μg/L）。判斷依據(jù)：測定未知標本的同時，以系列濃度標準品測得的劑量反應曲線（即標準曲線）以此推算未知標本的濃度。劑量反應曲線：一般均為非線性的，不同的數(shù)學模式可以用來改善上述劑量反應曲線繪制的精密度，從而以較少的數(shù)據(jù)和計算獲得較為準確的結(jié)果。應用：非傳染性血清學指標。,免疫測定中的劑量反應曲線,（相對于定量生化）：非線性→測定反應和待測物濃度之間的關(guān)系不一定是一條簡單的直線；可

7、能存在與系列標準品的測定數(shù)據(jù)擬合的多條曲線→可能因曲線的選擇而造成偏差；具有相對大的且方差不齊的測定誤差，且在標準曲線的不同位置、在不同批的測定之間這種誤差亦不同。,單純線性回歸往往不能反應真實情況,Figure 1 Falsely low and falsely elevated assay values resulting from drawing a straight line for the calibration curve

8、.,,數(shù)據(jù)處理與科學作圖,問題：給定一批離散的數(shù)據(jù)點，需確定滿足特定要求的曲線或 曲面,從而獲取整體的規(guī)律。目標：用一個解析函數(shù)描述一組（二維）數(shù)據(jù)(通常是測量值)。方法：插值法 -- 數(shù)據(jù)假定是正確的，要求以某種方法描述數(shù)據(jù)點之間所發(fā)生的情況；曲線擬合或回歸-- 設法找出某條光滑曲線，使它最佳 地擬合數(shù)據(jù)，但不必要經(jīng)過任何數(shù)據(jù)點。曲線及相應數(shù)學公式表明數(shù)據(jù)對（如標準品濃度與測定信號）之間

9、的比例關(guān)系。,擬合 與 插值 的 比 較,,數(shù)據(jù)擬合：又稱曲線擬合或曲面擬合，不要求曲線（面）通過所有數(shù)據(jù)點，而是要求它反映對象整體的變化趨勢時應用。,插值：要求所求曲線（面）通過所給所有數(shù)據(jù)點時應用；,從幾何意義上看，擬合是給定了空間中的一些點，找到一個已知形式的連續(xù)曲面來最大限度地逼近這些點；而插值是找到一個(或幾個分片光滑的)連續(xù)曲面來穿過這些點。,線性內(nèi)插與2階曲線擬合,,插值法 interpolative methods,假設

10、：反應變量的已知絕對精密；曲線構(gòu)建：以觀察到的數(shù)據(jù)構(gòu)建曲線；方法：點對點（線性插值）樣條插值 spline function,點對點（線性插值）,假設：中間值落在數(shù)據(jù)點之間的直線上；當數(shù)據(jù)點個數(shù)增加和它們之間距離減小時，線性插值就更精確；適用范圍：線性范圍大或數(shù)據(jù)點多且相互緊密相連；處理：為使數(shù)據(jù)更具有線性關(guān)系，可對數(shù)據(jù)進行某些方式的轉(zhuǎn)換（如對數(shù)轉(zhuǎn)換），然后在轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)上進行線性插值。,將臨近的校準點以點對點的方式用一

11、條直線連起來。,線性插值在免疫檢測中的應用：,采用某些更光滑的曲線來擬合數(shù)據(jù)點；最常用的方法是3階多項式，對相繼數(shù)據(jù)點之間的各段建模，這種類型的插值被稱為3次樣條或簡稱為樣條；處理：為將每一個短曲線相互之間平滑地連起來，需對其進行修飾（smoothing），這需要反復重新計算所有的曲線直至每一片段與其數(shù)據(jù)點的擬合間的連接可以接受。結(jié)點（knots，校準物的濃度值）越多意味著數(shù)據(jù)處理工作量的增大；適用范圍：當希望曲線密切遵循單個的

12、校準物數(shù)據(jù)點時，或數(shù)據(jù)非常精密并有多個校準物時可選用，否則應避免使用；,樣條插值 spline function,將臨近的校準點以一條曲線連起來，對整個標準曲線上各點間的短片段進行數(shù)學計算得到一條曲線，所獲得的合成數(shù)學函數(shù)稱為樣條函數(shù)。,線性插值 樣條插值,兩種插值結(jié)果完全不同，因為插值是一個估計或猜測的過程，其意義在于，應用不同的估計規(guī)則導致不同的結(jié)果。,樣條插值與線性插值：,,,特點：完全擬合試驗數(shù)據(jù)；

13、 每一片段基本上與其他部分無關(guān)；問題：對數(shù)據(jù)點的精密度和準確性依賴大； 每一個片段都應有一個質(zhì)控樣本，而這往往是做不到的； 無法完全解決hooks出現(xiàn)引起的不準確； 有時較其他“復雜”模式更費時。影響因素：確定某部分曲線的兩個校準點的準確度和精密度。,插值法interpolative methods及其應用,曲線構(gòu)建：以符合數(shù)據(jù)點規(guī)律的經(jīng)驗模式構(gòu)建曲線；目標：反映對象整體的變化趨勢；達到最佳擬合的方法

14、——線性最小二乘準則；擬合模式：雙曲線模式 hyperbolic model多項式模式 polynomial modelLog-Logit轉(zhuǎn)換Logistic公式（兩參數(shù)，四參數(shù)）,曲線擬合與回歸 curve fitting,曲線擬合問題的提法：已知一組（二維）數(shù)據(jù)，即平面上 n個點（xi,yi) i=1,…n, 尋求一個函數(shù)（曲線）y=f(x), 使 f(x) 在某種準則下與所有數(shù)據(jù)點最為接近，即曲線擬合得最好。,1. 通

15、過機理分析建立數(shù)學模型來確定 f(x)；2. 將數(shù)據(jù) (xi,yi) i=1, …n 作圖，通過直觀判斷確定 f(x)：,擬合函數(shù)的選擇：,2階曲線擬合與10階曲線擬合,n=1作為階次，得到最簡單的線性近似。通常稱為線性回歸；n=2作為階次，得到一個2階多項式；高階多項式給出很差的數(shù)值特性，不應選擇比所需的階次高的多項式。,擬合曲線的階次：,,,,,,,,,,,,,,雙曲線模式 hyperbolic curve：曲線形狀：雙

16、曲線；假定數(shù)據(jù)擬合下式：y=a+b(1/x) 或(1/y)=p+q(x)。,多項式模式：曲線形狀：拋物線；假定校準曲線擬合下述曲線形式；y=a+bx+cx2+dx3+……+pxn。,Log-Logit轉(zhuǎn)換：曲線形狀：具有單點屈曲的連續(xù)性S形函數(shù)；假定校準曲線擬合下述曲線形式：logit（y）=a+b*ln（x），其中l(wèi)ogit（z）=ln[z/（1-z）]。,Logistic公式（兩參數(shù)，四參數(shù)）：曲線形狀：

17、具有單點屈曲的連續(xù)性S形函數(shù)；假定校準曲線擬合下述曲線形式：logistic公式：Y= +dx以對數(shù)表示時曲線呈線性。,擬合模式：,1）將校準物濃度的倒數(shù)對測定反應作圖或以B0/B對校 準物濃度作圖；2）最小平方線性回歸。,雙曲線擬合 hyperbolic curve：,y=a+b(1/x) 或(1/y)=p+q(x),問題：標準曲線的端值得不到好的擬合（特別是低濃度端）；測定誤差

18、為倒數(shù)，與實際誤差規(guī)律相反；不具有S形，限制了應用。雙曲線擬合模式：競爭性免疫測定數(shù)據(jù)（在限定范圍內(nèi)的值）能擬合很好的平滑曲線。,雙曲線模式 hyperbolic curve應用,1）將測定反應對校準物濃度作圖；2）對多項式進行最小平方回歸。,多項式擬合：,適用范圍：一個三次多項式可被快速和成功地用于競爭免疫測定數(shù)據(jù)擬合；非競爭性免疫測定：有部分校準曲線為直線，可能擬合不好；x的次方為非整數(shù)時能夠再現(xiàn)校準曲線的實際線性部

19、分，但在零濃度附近和高濃度時不準確，需要截尾。問題：一個給定反應值可能對應兩個結(jié)果，因此需對校正曲線進行截尾。,多項式模式應用,1）將logit （B/B0）對校準物濃度的對數(shù)作圖；2）對轉(zhuǎn)換后的曲線進行最小平方回歸可得到良好的直線。,Log-Logit 轉(zhuǎn)換曲線：,logit（y）=a+b*ln（x）,logit（y）=a+b*ln（x）,適用范圍：競爭免疫測定數(shù)據(jù)擬合。問題：不能包含零校準物點；不能包含放免中的非特

20、異結(jié)合數(shù)據(jù)。,Log-Logit轉(zhuǎn)換應用：,1）將測定反應對校準物濃度的對數(shù)作圖；2）對轉(zhuǎn)換后的曲線進行最小平方回歸。,Logistic公式（兩參數(shù)，四參數(shù)） ：,Y=（a-d）/[1+（X/C）b]+d兩參數(shù)：a=y0，d=yx y=（y0-yx）/[1+（X/C）b]+yx Y=log(y0-y)/(y-yx)=logit(y), X=log(x), A=-b, B=-blog(c)

21、 Logit(y)=Alog(x)+B四參數(shù)：不依賴于y0和yx的測定，更好地擬合原始數(shù)據(jù)。,優(yōu)點：不會出現(xiàn)鉤狀（hooks）；問題：與直線公式相比logistic公式在代數(shù)學上是一個相當復雜的公式，因此要找出“最佳擬合”相對較難；參數(shù)：a，b，c，d四參數(shù)，或帶入a&d值，則為b，c兩參數(shù)。,,Logistic公式（兩參數(shù)，四參數(shù)）應用,例：在fPSA免疫分析中，四參數(shù)logistic擬合和四次多項式擬合

22、最接近真實值。,Figure 2 Effect of curve-fitting program applied on the degree (extent) of deviation of fPSA values from expected mean values of fPSA (represented by the dotted horizontal line).,劑量反應曲線：通常為S形或雙曲線。目標：曲線線性化，獲得數(shù)學模

23、式。方法：轉(zhuǎn)換一個或兩個變量（對數(shù)或倒數(shù)）；多項或其他方式的曲線線性回歸或比例轉(zhuǎn)換(logit)。最低要求：應用時經(jīng)濟省時；一個反應變量只對應一個劑量結(jié)果（無hooks出現(xiàn)）。,總結(jié)：曲線擬合及其應用,質(zhì)量作用定律模式和Scatchard作圖,曲線構(gòu)建：從化學原理（抗原抗體之間的反應符合質(zhì)量作用定律）計算校準曲線。原理：Ag+Ab?AbAg ， Ka= ， =Ka（n-[AbAg

24、]）n為反應孔中抗體的最大結(jié)合能力，以mol/g抗體表示，Ka是平衡常數(shù)。Scatchard plot 繪制方法：以[AbAg]/[Ag]比值對[AbAg]作圖可得到一條直線；計算機軟件作圖。,特點：以化學理論為基礎，給出了免疫測定的化學本質(zhì)，比其他經(jīng)驗模式更可靠。問題：在實際反應中往往只在一定濃度范圍內(nèi)呈線性，受到以下條件限制— 1）抗原抗體均一（標記物與非標記物）和單價（多抗）； 2）抗原抗體反應

25、必須達到平衡（非一步反應）； 3）抗原抗體按照一級質(zhì)量作用定律反應，無改變抗體或抗原反應性的作用，如協(xié)同作用或變構(gòu)作用； 4）結(jié)合和游離物濃度必須為真正的測定值。使用范圍： 非競爭免疫測定中雙抗夾心測定不能用。,Scatchard作圖及其應用,相關(guān)應用軟件,Thermo labsystems酶標儀：可進行的曲線擬合類型包括LINEAR REGRESSION， POINT TO POINT， QUAD. P

26、OLYNOMIAL， CUBIC POLYNOMIAL， CUBIC SPLINE， QUARTIC POLYNOMIAL， 4 PARAM. LOGISTIC，從中選出最佳擬合（“best fit”）。Program：RIA AID, ELISA AID (Robert Maciel Associates, Inc. Arlington, MA) 通用的處理程序，可進行l(wèi)og-logit(加權(quán)、非加權(quán)）、四參數(shù)logistic擬合

27、、多項式擬合、點對點擬合等，可用于RIA和EIA。CurveExpert 1.3：linear regression models, nonlinear regression models, interpolation, or splines. Over 30 models。,摘自生物軟件網(wǎng) www.bio-soft.net,有關(guān)概念,準確度accuracy—實驗測得的分析物濃度與其真值之間符合程度。標準差standard dev

28、iation, SD —一組數(shù)據(jù)的離散度。變異系數(shù)coefficient of variation, CV —標準差以其均數(shù)的百分比來表示。重復性reproducibility —通過重復測定的SD或算術(shù)平均值的區(qū)間值來考察。測定下限detectability —超過零劑量精密度的最低抗原濃度。敏感性sensitivity —實驗的測定反應對待側(cè)物質(zhì)濃度變化的改變，即dR/dC。,夾心ELISA校準曲線,優(yōu)化：為得到更大的線性

29、范圍，可提高包被抗體和檢測抗體的用量；標準曲線的不同位置精確度不同，這影響到標準曲線上數(shù)據(jù)點的疏密分布，并需要相應的質(zhì)控品；不同批標準曲線之間亦有誤差，因此每批實驗都應重新坐標準確性。,Referrence,李金明，臨床酶免疫測定技術(shù). 人民軍醫(yī)出版社，2005.James T. Wu, PhD. Quantitative immunoassay: a practical guide for assay establishm

30、ent, troubleshooting, and clinical application.數(shù)學建模與數(shù)學實驗—擬合，海軍航空工程學院青島分院教程.曲線擬合與插值.Stephen P. FitzGerald, etc. Development of a High-Throughput Automated Analyzer Using Biochip Array Technology. Clinical Chemistry