羅氏公司tunel細(xì)胞凋亡檢測(cè)程序

1、羅氏公司羅氏公司TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)程序細(xì)胞凋亡檢測(cè)程序作者：Roche發(fā)表于：2009030614:54來源：丁香園（InsitucelldeathdetectionkitPOD法）法）一、一、原理：原理：TUNEL（TdTmediateddUTPnickendlabeling）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒是用來檢測(cè)組織細(xì)胞在凋亡早期過程中細(xì)胞核DNA的斷裂情況。其原理是熒光素（fluescein）標(biāo)記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（T

2、dTEnzyme）的作用下，可以連接到凋亡細(xì)胞中斷裂DNA的3’OH末端，并與連接辣根過氧化酶（HRP，hseradishperoxidase）的熒光素抗體特異性結(jié)合，后者又與HRP底物二氨基聯(lián)苯胺（DAB）反應(yīng)產(chǎn)生很強(qiáng)的顏色反應(yīng)（呈深棕色），特異準(zhǔn)確地定位正在凋亡的細(xì)胞，因而在光學(xué)顯微鏡下即可觀察凋亡細(xì)胞；由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有DNA斷裂，因而沒有3‘OH形成，很少能夠被染色。本試劑盒適用于組織樣本（石蠟包埋、冰凍和超薄切

3、片）和細(xì)胞樣本（細(xì)胞涂片）在單細(xì)胞水平上的凋亡原位檢測(cè)。還可應(yīng)用于抗腫瘤藥的藥效評(píng)價(jià)，以及通過雙色法確定細(xì)胞死亡類型和分化階段。二、二、器材與試劑器材與試劑器材：光學(xué)顯微鏡及其成像系統(tǒng)、小型染色缸、濕盒（塑料飯盒與紗布）、塑料蓋玻片或封口膜、吸管、各種規(guī)格的加樣器及槍頭等；試劑：試劑：試劑盒含TdT10、熒光素標(biāo)記的dUTP1、標(biāo)記熒光素抗體的HRP；自備試劑：PBS、雙蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、DAB

4、工作液（臨用前配制，5μl20DAB1μL30%H2O294μlPBS）9.可以加1滴PBS在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞（激發(fā)光波長(zhǎng)為450~500nm，檢測(cè)波長(zhǎng)為515~565nm）；10.玻片干后加50μlconverterPOD于標(biāo)本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應(yīng)37℃30min。11.PBS漂洗3次；12.在組織處加50~100μlDAB底物，反應(yīng)15~25℃10min；13.PBS漂洗3次；14.拍照后再用蘇木素或甲基綠復(fù)染

5、，幾秒后立即用自來水沖洗。梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。15.加一滴PBS或甘油在視野下，用光學(xué)顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞（共計(jì)200~500個(gè)細(xì)胞）并拍照?？山Y(jié)合凋亡細(xì)胞形態(tài)特征來綜合判斷（未染色細(xì)胞變小，胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，晚期出現(xiàn)凋亡小體，貼壁細(xì)胞出現(xiàn)鄒縮、變圓、脫落；而染色細(xì)胞呈現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解，染色質(zhì)分割成塊狀凋亡小體）四、四、注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)1.進(jìn)行PBS清洗時(shí)，每次清洗5min。2.PBS清洗后，為了各