北柴胡藥材種質(zhì)資源的化學(xué)與遺傳分析.pdf

1、柴胡為常用中藥材，具有解表和里、舒肝解郁、升提中氣等功效，中國(guó)藥典收載柴胡（Bupleurum chinense DC.）和狹葉柴胡（B.scorzonerifolium Willd.）的干燥根。我國(guó)各地約有25種柴胡屬植物作藥用，種質(zhì)資源豐富，但商品藥材以栽培北柴胡為主，由于地域分布廣泛，且不同地區(qū)之間相互引種，致使藥材質(zhì)量現(xiàn)狀不明確，種質(zhì)親緣關(guān)系不清，給柴胡的臨床準(zhǔn)確用藥和資源利用帶來(lái)困難。本研究在大量收集以北柴胡為主的柴胡種質(zhì)資源

2、基礎(chǔ)上（共收集118份樣本），從化學(xué)和分子生物學(xué)的角度，結(jié)合形態(tài)學(xué)、引種栽培試驗(yàn)、資源調(diào)查、本草考證等研究手段，全面分析評(píng)價(jià)北柴胡的種質(zhì)資源狀況，為合理利用柴胡藥材及基因資源提供科學(xué)基礎(chǔ)。
　　化學(xué)分析:首次建立了基于NMR技術(shù)的柴胡藥材代謝組學(xué)分析方法，樣品采用氯仿、甲醇-水兩相提取法，其有機(jī)相用氘代甲醇溶解，水相用含緩沖液的氘代水溶解，氫譜核磁分析條件為:500兆NMR儀，頻率H-NMR500.13NHE，128 Scan，0

3、.126Hz/point;pulse width(pw)=4.0μs(30℃)relaxtion delag=2.0s;Fid轉(zhuǎn)換LB=0.3 HE。多元數(shù)據(jù)軟件SIMCA-P11.0。
　　建立了HPLC柱前酸化處理同時(shí)測(cè)定柴胡皂苷a、d含量的方法，以單因素結(jié)合正交試驗(yàn)優(yōu)選酸化理?xiàng)l件為:藥材提取液加入8％鹽酸于30℃恒溫反應(yīng)18h，用8％KOH調(diào)節(jié)pH值至中性。色譜條件為:Hypersil ODS-C18柱(200mm×4.6m

4、m，5μm)，檢測(cè)波長(zhǎng)250nm，流動(dòng)相乙腈-0.05％H3PO4(38:62)，流速:1.0mL·min-1，柴胡皂苷a線性范圍0.119～2.38μg(r=0.9998)，平均回收率99.96％(RSD=1.67％)，柴胡皂苷d線性范圍0.157～3.14μg（r=0.9994），平均回收率98.73％(RSD=1.28％);
　　建立了基于HPLC-UV的柴胡代謝物輪廓分析方法，改進(jìn)了流動(dòng)相酸的種類(lèi)，解決了因紫外末端吸收所引

5、起的基線不平穩(wěn)問(wèn)題，獲得了理想的HPLC圖譜，色譜條件為:色譜柱Diamonsil（鉆石）C18(200mm×4.6mm，5μm)，檢測(cè)波長(zhǎng)203nm，以乙腈（0.02％三氟乙酸）-水（0.02％三氟乙酸）為流動(dòng)相，梯度洗脫，流速1.0mL·min-1。
　　經(jīng)上述化學(xué)分析評(píng)價(jià)，柴胡藥材不同種北柴胡、紅柴胡和黑柴胡的代謝產(chǎn)物可明顯區(qū)別，其中紅柴胡與北柴胡更接近，而非藥典收載品黑柴胡與上述兩種正品柴胡的差異較大;北柴胡種內(nèi)不同產(chǎn)地或

6、野生與栽培品間藥材的化學(xué)成分相似度高，均一性良好;藥材中柴胡皂苷含量在甘肅、陜西的主產(chǎn)區(qū)中均較高，山西的樣品含量差異較大，其中陵川、左權(quán)、平陸、長(zhǎng)治等地種質(zhì)的柴胡皂苷含量較高。
　　遺傳分析:建立了柴胡植物不同組織AFLP分子標(biāo)記方法，其中以藥材干根提取高質(zhì)量DNA最困難，但更適用于中藥材的分子鑒定和多樣性分析，具體方法為:藥材研磨時(shí)加入3％ PVP粉末及2倍量石英砂，液氮快速磨成細(xì)粉，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，低溫條件下TNE洗滌2次

7、，CTAB方法提取基因組DNA，酶切模板DNA(50ng/μl)4μl，連接產(chǎn)物稀釋10倍作為預(yù)擴(kuò)增模板，選擇性擴(kuò)增引物3對(duì):E-AAC/M-CTA、E-AGG/M-CTG和E-AGG/M-CAA，擴(kuò)增條帶總數(shù)為188條，其中多態(tài)性條帶為167條，多態(tài)性比率為88.83％。
　　用建立的方法對(duì)64個(gè)樣品研究，由于多數(shù)材料貯藏時(shí)間在兩年以上，只有23個(gè)樣品提取到高質(zhì)量DNA，經(jīng)AFLP分析，柴胡不同種的藥材可明顯分開(kāi)，且兩個(gè)正品物種

8、北柴胡和紅柴胡的遺傳距離較近，而非藥典種黑柴胡距它們較遠(yuǎn)，以北柴胡為中心的遺傳距離遠(yuǎn)近順序?yàn)?北柴胡—紅柴胡—黑柴胡;另對(duì)18個(gè)北柴胡樣品進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，所建立的AFLP方法可用于柴胡種下不同居群的分類(lèi)，將來(lái)自三個(gè)不同?。ǜ拭C、山西、陜西）的北柴胡分成3類(lèi)，且還可依據(jù)親緣關(guān)于推測(cè)不明身份種子可能的原產(chǎn)地。遺傳和化學(xué)分析結(jié)果在柴胡種間的分類(lèi)是一致的，提示不同種的化學(xué)表型差異主要由遺傳分子差異所決定，但北柴胡的種內(nèi)主要地理居群在DNA分子上

9、的差異性并未引起化學(xué)類(lèi)型的明顯差異，提示產(chǎn)地環(huán)境對(duì)北柴胡的代謝產(chǎn)物可能有趨同影響，即商品北柴胡的均一性良好。
　　引種栽培試驗(yàn):采用旱作栽培法將13份不同產(chǎn)地的柴胡種子，在山西3個(gè)不同點(diǎn)進(jìn)行引種栽培試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)柴胡的生育期主要受引種地和原產(chǎn)地相對(duì)緯度及海拔的影響，而營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期的長(zhǎng)短將影響柴胡藥材根的產(chǎn)量，生殖生長(zhǎng)期的長(zhǎng)短和引種地的溫度將影響柴胡種子的成熟度;柴胡中有效成分柴胡皂苷的含量首先受遺傳因素控制，其次受產(chǎn)地環(huán)境影響。高柴

10、胡皂苷含量的種質(zhì)有甘肅隴西和隴南地區(qū)、陜西寶雞與商洛以及山西陵川、平陸等縣;柴胡適宜種植地除上述種源產(chǎn)地外，還有山西的晉東南、晉南及晉中地區(qū)，山西不太適宜的產(chǎn)地主要為雁北地區(qū)。北柴胡異地引種后藥材性狀總體很相似，根的粗細(xì)、彎直、分支與不分支、顏色等方面的變化不是可穩(wěn)定遺傳的變異，主要受具體種植地塊的厚薄、松緊及土壤類(lèi)型等影響。本研究結(jié)果提示，柴胡的種植生產(chǎn)可在不同緯度或海拔地區(qū)分別建藥材生產(chǎn)基地與種子繁育基地，以達(dá)到提高藥材產(chǎn)量和質(zhì)量，

11、保證種子成熟飽滿(mǎn)的目的。
　　本草學(xué)研究認(rèn)為習(xí)用藥材名“南柴胡”應(yīng)改為“紅柴胡”更妥;藥源調(diào)查表明栽培北柴胡已成為柴胡藥材的主流商品，種植規(guī)模位列前位的有甘肅、山西和陜西等省。
　　結(jié)論:本研究將中藥學(xué)、植物學(xué)、分析化學(xué)、分子生物學(xué)、農(nóng)學(xué)、化學(xué)計(jì)量學(xué)等技術(shù)相結(jié)合，對(duì)北柴胡種質(zhì)資源進(jìn)行了深入系統(tǒng)的研究，明確了北柴胡藥材質(zhì)量基本現(xiàn)狀，即栽培北柴胡藥材的質(zhì)量均一性較好，可替代野生品，種質(zhì)相對(duì)野生品更純化。北柴胡與近緣種正品紅柴胡有