誘變物質(zhì)的微核測(cè)試及其應(yīng)用

1、設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn),小組成員：黃金匯 魏青 卞徐磊 唐曉婧 劉欣欣 周偉 徐振揚(yáng),2008年10月,生技0611 第5組,誘變物質(zhì)的微核測(cè)試及其應(yīng)用,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)用實(shí)驗(yàn)室自來(lái)水（對(duì)照組）、洗滌劑、新校區(qū)河道污水、一定范圍內(nèi)不同濃度的硫酸銅溶液處理蠶豆根尖，通過(guò)觀察計(jì)數(shù)后計(jì)算蠶豆根尖細(xì)胞微核千分率得出樣品溶液污染指數(shù)。,摘要,結(jié)果表明：七種處理液處理后的蠶豆根尖細(xì)胞的微核千分率分別為2.00‰、2.67‰、4.67‰、3.67‰ , 4.00‰，

2、5.33‰，6.33‰ 六種樣品污染指數(shù)分別為1.33，2.33，1.83，2.00，2.67，3.17。這表明學(xué)校新校區(qū)存在中度污染，應(yīng)注意環(huán)境的保護(hù)。,前言：隨著科技的飛速發(fā)展，不斷有新的化學(xué)物質(zhì)和“工業(yè)三廢”進(jìn)入我們的生活，它們中許多都是“致畸、致癌、致突變”的物質(zhì)，可以對(duì)人類健康產(chǎn)生巨大的威脅。微核試驗(yàn)(micronucleus test，MCNT)是以動(dòng)植物為材料，觀測(cè)材料細(xì)胞出現(xiàn)的微核率來(lái)表示材料受遺傳損傷程度從而檢測(cè)遺傳

3、毒物的一種方法。在各種微核實(shí)驗(yàn)中，常采用蠶豆(vcia faba)根尖細(xì)胞微核法，蠶豆根尖細(xì)胞微核試驗(yàn)(Mircronu—cleus test，簡(jiǎn)稱MCNT)技術(shù)是一種以染色體損傷及紡錘絲毒性等為測(cè)試點(diǎn)的植物微核檢測(cè)方法，此可用微核率大小來(lái)表示誘變因子的強(qiáng)弱。我國(guó)科學(xué)家陳光榮在I983年開(kāi)始用蠶豆根尖微核技術(shù)(Vicia MCN)來(lái)檢測(cè)農(nóng)藥和化學(xué)誘變劑對(duì)染色體的損傷情況。目前利用蠶豆初生根尖微核技術(shù)監(jiān)測(cè)環(huán)境污染和危險(xiǎn)化學(xué)品的研究已得到了

4、廣泛的應(yīng)成為我國(guó)水環(huán)境監(jiān)測(cè)的規(guī)范化方法之一[2]；利用蠶豆根尖細(xì)胞微核技術(shù)以下優(yōu)越性：方法簡(jiǎn)便，鑒別客觀，易于掌握，不需要特殊的儀器和藥品，敏度高，可靠性強(qiáng)；而且有顯而易見(jiàn)的實(shí)用性，且蠶豆根尖細(xì)胞周期中大部分時(shí)間處于對(duì)誘變劑敏感的間期，便于遺傳毒性檢測(cè)試驗(yàn)，精確度也比較高，現(xiàn)已廣泛地應(yīng)用于污水的檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)就是利用蠶豆根尖微核檢測(cè)技術(shù)對(duì)新校區(qū)河道污水水質(zhì)污染，生活用品，化學(xué)用品的情況進(jìn)行評(píng)價(jià)。,關(guān)鍵詞： 蠶豆 微核 污染指數(shù),

5、一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模骸盍私饧?xì)胞微核形成的機(jī)理及其形態(tài)特點(diǎn)☆學(xué)習(xí)植物根尖細(xì)胞的微核測(cè)試技術(shù)☆進(jìn)行小組合作，掌握設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)基本能力,正文 : 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) ，實(shí)驗(yàn)過(guò)程等,二、實(shí)驗(yàn)原理： 微核是真核細(xì)胞中的一種異常結(jié)構(gòu)，往往是細(xì)胞經(jīng)輻射或化學(xué)藥物的作用而產(chǎn)生。在細(xì)胞間期微核呈圓形或橢圓形，游離于主核外，大小應(yīng)在主核1/3以下，微核測(cè)試是一種以染色體損傷及紡錘絲毒性等為測(cè)試點(diǎn)的微核檢測(cè)方法，用微核率大小表示誘變因子強(qiáng)弱，經(jīng)證實(shí)微核率大

6、小和用藥的劑量或輻射累積效應(yīng)呈正相關(guān)。,三、實(shí)驗(yàn)材料：蠶豆 實(shí)驗(yàn)用具和藥品：●顯微鏡、載玻片、蓋玻片、培養(yǎng)皿、濾紙、電子天平、試管、鑷子、 廣口瓶、脫脂棉等；●無(wú)水乙醇、冰醋酸、改良石炭酸品紅染液、HCl等；●洗滌劑，新校區(qū)河道污水、硫酸銅。,四、實(shí)驗(yàn)過(guò)程：,1.浸種催芽（10月1日-6日） 選擇無(wú)蟲(chóng)、飽滿、大小均勻的蠶豆種子40粒放入盛有自來(lái)水的培養(yǎng)皿中， 25℃浸泡24h,其中換水2次。種子吸脹

7、后，在培養(yǎng)皿中鋪一層脫脂棉，倒入少量自來(lái)水，將種子置于其中培養(yǎng)5天，大部分初生根長(zhǎng)至1～2cm左右。,2.處理液的配置◇對(duì)照組自來(lái)水直接由實(shí)驗(yàn)室取得；◇配制12.5mg/L,25mg/L,50mg/L,100mg/L四種濃度的硫酸銅溶液；◇取洗滌劑稀釋5倍備用；◇取新校區(qū)河道污水稀釋5倍備用。,四、實(shí)驗(yàn)過(guò)程：,3.處理（10月7日12：30-16：30） 用上述七種處理液處理根尖，每一處理選取4-5粒初生根良好、根長(zhǎng)較一

8、致的種子，置于盛有被檢測(cè)液的培養(yǎng)皿中，被測(cè)液浸沒(méi)根尖即可，貼上標(biāo)簽，處理4h。,4.根尖細(xì)胞恢復(fù)培養(yǎng)（10月7日17：00-10月8日16：00） 處理后的種子用蒸餾水浸洗三次，每次2～3分鐘。洗凈后置于鋪有脫脂棉的培養(yǎng)皿中，加自來(lái)水于25℃恒溫箱中恢復(fù)培養(yǎng)23h。,5.根尖細(xì)胞固定（10月8日16：30-10月9日13：30） 將恢復(fù)培養(yǎng)后的種子，從根尖頂端切下1cm長(zhǎng)的幼根放入廣口瓶中，以無(wú)水乙醇：冰醋酸=3：1的比

9、例配制卡諾氏固定液，倒入廣口瓶進(jìn)行固定21h。,四、實(shí)驗(yàn)過(guò)程：,6.解離、染色、壓片 用蒸餾水浸洗固定好的幼根兩三次，每次3分鐘，吸去蒸餾水，加入1mol/L鹽酸將幼根浸沒(méi)，于60℃水浴解離20分鐘，幼根軟化即可。然后吸去鹽酸，用蒸餾水浸沒(méi)清洗幼根三次，每次1～2分鐘。在凹面玻片內(nèi)滴加改良石炭酸品紅染液，染色10分鐘，制片前取出置載玻片上，截下1～2mm左右長(zhǎng)的根尖，滴改良石炭酸品紅染液，加上蓋玻片，覆一層吸水紙，用解剖針或鑷子

10、垂直敲打，然后以拇指垂直緊壓蓋片（注意勿使蓋片搓動(dòng)），使材料分散壓平，便于觀察。,7.鏡檢觀察計(jì)數(shù) 在常規(guī)制片后，將玻片標(biāo)本放在顯微鏡的低倍鏡下觀察，找到分生組織區(qū)細(xì)胞分散良好、核膨大、分裂相對(duì)較多的部分轉(zhuǎn)到高倍鏡下進(jìn)行觀察。在顯微鏡下觀察微核個(gè)數(shù)，數(shù)900～1000個(gè)蠶豆根尖細(xì)胞，記下含有微核的個(gè)數(shù)，計(jì)算出各個(gè)處理的蠶豆根尖微核千分率（MCN ‰）并與自來(lái)水對(duì)照組相比得出污染指數(shù)（PI）。,五、數(shù)據(jù)分析方法：,根據(jù)觀測(cè)結(jié)果，計(jì)

11、算各處理下微核的千分率，并根據(jù)下述算式計(jì)算各處理的微核率污染指數(shù)：◆微核率（MCN‰）=測(cè)試樣品（或?qū)φ眨┯^察到的微核個(gè)數(shù)/測(cè)試樣品（或?qū)φ眨┯^察細(xì)胞總數(shù)×1000‰ ◆污染指數(shù)（PI）=樣品微核千分率平均值/對(duì)照水樣微核千分率平均值 污染指數(shù)在0～1.5區(qū)間，基本沒(méi)有污染，在1.5～2區(qū)間,為輕度污染,在2～3.5區(qū)間為中度污染，在3.5以上為重度污染。,六、結(jié)果與分析：,1. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果,各檢測(cè)樣本引起的

12、蠶豆根尖細(xì)胞微核率的鏡檢結(jié)果記載表,六、結(jié)果與分析：,從表中可以看出：▲新校區(qū)河道污水在稀釋了5倍后為中度污染， ▲100.0mg/L的硫酸銅溶液污染指數(shù)最大，表明其對(duì)供試材料有較強(qiáng)烈的致畸作用?！廴境潭刃滦^(qū)河道污水>洗滌劑>自來(lái)水▲通過(guò)本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同濃度硫酸銅溶液微核率的檢測(cè)可推斷硫酸銅濃度在0-100mg/L間微核率與溶液濃度呈正相關(guān)。,六、結(jié)果與分析：,2. 分析討論,誤差分析：處理時(shí)間較短

13、，僅4小時(shí)，檢測(cè)的微核率較??；鏡檢時(shí)，由于細(xì)胞數(shù)量較多，視野較小，在數(shù)數(shù)上也存在一定誤差。,選材：由于蠶豆易于培養(yǎng)，對(duì)誘變物質(zhì)敏感等優(yōu)點(diǎn)，所以選擇蠶豆為本次實(shí)驗(yàn)材料。選擇洗滌劑是因?yàn)橄肓私馊粘Ｓ闷返奈廴局笖?shù)、對(duì)我們皮膚等的傷害，由于蠶豆數(shù)量有限，放棄了對(duì)洗衣粉，消毒液等的檢測(cè)而選擇了洗滌劑作為代表。另外，我們還想了解重金屬離子對(duì)蠶豆根尖的毒害作用，但擔(dān)心濃度過(guò)高會(huì)殺死根尖，因此配制0-100mg/L的四個(gè)濃度梯度的硫酸銅溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。這

14、樣可以在橫向核縱向上對(duì)蠶豆實(shí)驗(yàn)以得出較好的結(jié)果。,污染問(wèn)題：通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)洗滌劑在稀釋了5倍后基本沒(méi)有污染，平時(shí)使用中稀釋倍數(shù)更大，因而安全性較好，而新校區(qū)河道污水在稀釋了5倍后為中度污染，可以認(rèn)為未稀釋的水污染比較嚴(yán)重，經(jīng)過(guò)分析討論認(rèn)為主要是新校區(qū)的建設(shè)還未完成，施工對(duì)河道產(chǎn)生污染，此外還有宿舍樓的生活污水也對(duì)其有危害。,六、結(jié)果與分析：,3. 思考與建議,在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中我們想到用孔板法培養(yǎng)蠶豆，但由于實(shí)驗(yàn)器材的限制，我們?cè)谂囵B(yǎng)

15、中將脫脂棉摳了幾個(gè)洞便于培養(yǎng)以代替孔板的效果；,考慮到用被測(cè)液處理蠶豆根尖的時(shí)間長(zhǎng)短可能會(huì)影響微核率，但由于材料數(shù)量的限制等因素沒(méi)有去實(shí)踐，建議以后實(shí)驗(yàn)中把它加入；,用蠶豆實(shí)驗(yàn)測(cè)試河道污水準(zhǔn)確度不大，存在一定的缺點(diǎn)，因而要準(zhǔn)確掌握污染源的污染程度，應(yīng)用生物毒性測(cè)試與理化監(jiān)測(cè)相結(jié)合，以便有效地采用相應(yīng)措施保護(hù)水資源。,六、結(jié)果與分析：,結(jié)語(yǔ)： 蠶豆根尖微核試驗(yàn)是一種以染色體損傷及紡錘絲毒性等為測(cè)試終點(diǎn)的植物微核檢測(cè)方

16、法，是世界范圍內(nèi)推廣運(yùn)用的環(huán)境致突變性檢測(cè)技術(shù)。它具有許多其它方法無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)，比如蠶豆根尖微核技術(shù)在遺傳毒理檢測(cè)中具有良好的劑量效應(yīng)和較寬的檢測(cè)物譜，以蠶豆為試驗(yàn)材料成本很低，儀器較簡(jiǎn)單，不傷害操作工作人員的健康，比較適合縣市級(jí)下的地方環(huán)境監(jiān)測(cè)部門(mén)使用。,六、結(jié)果與分析：,參考文獻(xiàn)[1]陳瑞嬌;李均祥. 蠶豆根尖微核試驗(yàn)在環(huán)境致突變物檢測(cè)中的應(yīng)用[J].韶關(guān)學(xué)院學(xué)報(bào). 2006/27/9:87～90.[2] 王樊彥.蠶豆根尖

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