基礎(chǔ)毒性 ppt課件

1、基礎(chǔ)毒性作用Basic Toxicity,閻小艷 2016.9,基礎(chǔ)毒性（basic toxicity）：外源化學物質(zhì)在一定的劑量、一定的接觸時間和一定的接觸方式下對實驗動物產(chǎn)生總體毒性綜合效應的能力，又稱一般毒性（general toxicity）。,特殊毒性（special toxicity）：致突變作用、致癌作用、致畸作用和生殖發(fā)育毒性。,特殊毒性,基礎(chǔ)毒性,急性毒性,亞慢性毒性,慢性毒性,局部毒性：皮膚刺激，眼刺激,致癌作用

2、,生殖毒性,致畸作用,致突變作用,化學物毒性,,,,基礎(chǔ)毒性的研究意義,★外源性化學物質(zhì)安全性評價和危險性評價的重要組成部分，并為制訂衛(wèi)生標準和進行衛(wèi)生決策提供依據(jù)。 ★為毒作用機制和靶器官毒性研究提供線索 。,第一節(jié)　急性毒性作用 Acute Toxicity,急性毒性（acute toxicity）：,實驗指機體（人或?qū)嶒瀯游铮┮淮谓佑|或24小時內(nèi)多次接觸某一化學物質(zhì)在短期內(nèi)（最長14天）所引

3、起的毒性效應，包括一般行為、外觀改變、大體形態(tài)變化及死亡效應。,基本概念,一.概 述,急性中毒發(fā)病急驟，病情變化迅速，發(fā)展快。群體中毒，傷害人群多。據(jù)有關(guān)部門統(tǒng)計急性中毒是我國全部疾病死因的第5位。是急診急救易發(fā)生誤診誤治引發(fā)醫(yī)療糾紛的領(lǐng)域。因此急救醫(yī)護人員及時明確診斷，急分奪秒，緊張有序的救治，才能有效的控制中毒癥狀，降低死亡率和致殘率。,急性中毒,一.概 述,2.毒物種類工業(yè)性毒物：氰化物，硫化氫農(nóng)業(yè)性毒物：百

4、草枯日常生活性毒物：潔廁靈，稀料，汞，保健品植物性毒物：毒蘑菇動物性毒物,試驗目的,主要是探求化學物的毒性大?。ㄖ滤绖┝縇D50為主要參數(shù)，進行毒性分級），以初步評估其對人類毒害的危險性。闡明受試化學物的劑量－反應關(guān)系 (dose-response relationship)，為其它毒性試驗選擇染毒劑量打下基礎(chǔ)。粗略估計毒作用的靶器官，為可能的毒作用機制研究提供線索。,常用參數(shù),LD50（LC50）急性毒作用帶（Zａｃ）劑

5、量－反應曲線的斜率,LD50（LC50）,LD50 引起一群個體50％死亡所需的劑量，也稱致死中量（median lethal dose）。表示LD50的單位為mg/kg體重。LC50 引起一群個體50％死亡所需的濃度，一般以mg/m3表示空氣中外源性化學物質(zhì)濃度，或以mg/L表示水中外源性化學物質(zhì)濃度。,LD50（LC50）,是急性毒性評價中重要的參數(shù)是比較不同化學物質(zhì)毒性的重要參數(shù)但由于其是一個統(tǒng)計值，本身具有波動性

6、，僅是表示實驗動物一半死亡，一半存活的一個劑量界點值，不能很好的反映急性中毒的特征僅用其反映急性毒性的特征是有局限性的。,急性毒作用帶(acute toxic effect zone, Zac),Zac＝LD50/ Limac閾劑量（threshold dose） 是指外源性化學物質(zhì)按一定方式或途徑與機體接觸，能使機體開始出現(xiàn)某種最輕微的異常改變所需的最低劑量。一次染毒所得的閾劑量稱為急性閾劑量（Limac ）。,急性毒作用帶（

7、Zac),意義：Zac值大小可反映急性閾劑量距LD50之間距離的寬窄，即表示引起實驗動物的死亡劑量與最低毒作用劑量之間的寬窄。Zac值越大表明化學物質(zhì)引起急性死亡的危險性越小，反之危險性越大。,,,,,,A、B兩種物質(zhì)劑量－反應曲線,對數(shù)劑量,死亡率概率單位,5,A,B,,劑量－反應曲線的斜率,急性毒性試驗設(shè)計原則,1.實驗動物的選擇,2.染毒途徑的選擇,3.染毒劑量與分組,4.毒性癥狀觀察,(一)實驗動物的選擇,原則：選擇代謝功能、

8、對毒物感受性 與人接近的動物。常用：哺乳類動物,,物種：,急性毒性反應與人近似 易于飼養(yǎng)、操作方便 繁殖力較強 價格較低，易于獲得,,主要原則,1. 物種和品系,1.全年、多發(fā)情性動物2.性周期：4-5天3.一次排卵10-20個4.妊娠期為19～21天；5.每胎產(chǎn)仔數(shù)為8～15,Balb/c小鼠,起源于小家鼠Mus musculus。和NIH與NCR比較，遺傳背景為近交系，由親兄弟姐妹遺傳繁殖，因

9、而它們之間的個體差異就小，遺傳基因更純，整體素質(zhì)更好。 從1920年它們在紐約誕生至今，BALB/c小鼠在全球研究機構(gòu)繁衍了超過200代，廣泛用于免疫學、生理學的動物實驗。,大鼠,Wistar大鼠①性周期穩(wěn)定，早熟多產(chǎn)，平均每窩產(chǎn)仔10只左右， ②生長發(fā)育快，10周齡時雄鼠體重可達280～300g，雌鼠達170-260g。③性情溫順④對傳染病的抵抗力較強。⑤自發(fā)性腫瘤發(fā)生率低。⑥目前各地飼養(yǎng)的Wisstar大鼠的遺傳狀況差異較

10、大。,SD大鼠: ①生長快，繁育性能好，生長發(fā)育較Wistar為快。10周齡時雄鼠體重可達300~400g,雌鼠達180~270g。②性情比Wisar大鼠稍為兇猛。③對疾病的抵抗力較強，尤其對呼吸道疾病的抵抗力很強。④該品系對性激素敏感，對呼吸道疾病有較強的抵抗力。廣泛用于藥理、毒理、藥效及GLP實驗。,基本特性1921年立特(Little) 用艾比·拉特洛坡(Abby Lathrop) 的小鼠株，雌鼠57號與雄鼠52號交配

11、而得C57BL。1937年從C57BL分離出C57BL /6和C57BL/10兩個亞系。類別:近交系小鼠 毛色 :黑色 成熟期：  8-10周  交配比例 :1:2  發(fā)情周期 ：4-5天  妊娠期 : 19-21天  平均每窩產(chǎn)仔數(shù)（第一胎): 6只  哺乳期:  21天,C57BL

12、/6小鼠,①乳腺腫瘤自然發(fā)生率低，② 12％有眼部缺陷；③用可的松可誘發(fā)腭裂，其發(fā)生率達20％。④對放射物質(zhì)耐受力中等；⑤對結(jié)核桿菌敏感。是腫瘤學、生理學、免疫學、遺傳學研究中常用的品系。,,無胸腺裸鼠（Nude Mouse，簡稱裸鼠），主要特征表現(xiàn)為無毛（Hairless）、裸體（Naked）和無胸腺（Athymus）。先天性胸腺缺陷的突變小鼠，是由于第Ⅶ連鎖群（Linkage group）內(nèi)裸體位點的等位基因發(fā)生純合而形成的

13、突變小鼠新品種。因此缺乏免疫反應，是免疫缺陷動物。由于nu基因有獨特的遺傳特性。裸鼠（純合子nu/nu突變鼠）主要表現(xiàn)為無毛（但可看到一種細毛組織學證明有被毛濾泡）以及缺乏正常胸腺。雜合子小鼠（nn/+）各方面表現(xiàn)都正常。在腫瘤學、免疫學、藥品與生物制品的安全性評價及有效藥品的篩選等實驗方面，它有著特殊的價值。,裸鼠,組織移植（人類腫瘤移植）研究,由于裸鼠的免疫缺陷，在一定情況下，不排斥來自異種動物的組織移植。因此可作移植人類惡性腫

14、瘤的接受體。 人體腫瘤移植于免疫缺陷動物，能保持其生物學特性，用于研究人體腫瘤對藥物的敏感性有很大幫助。移植于裸鼠的人類惡性腫瘤具有以下特征：1．被移植腫瘤仍保持原有組織學構(gòu)造或各種機能。2．將人癌組織的組織培養(yǎng)物移種于裸鼠時，能重現(xiàn)已在組織培養(yǎng)中消失的原有的癌結(jié)構(gòu)。3．幾乎未發(fā)現(xiàn)被移植腫瘤的轉(zhuǎn)移。,常用的突變品系,常用的突變品系,豚鼠guinea pig,豚鼠,又名海豬、天竺鼠、荷蘭豬。草食性動物；喜群居；性情

15、溫順；膽小怕驚；壽命一般為4-5年，最長可達7年。1．生長發(fā)育： 豚鼠2月齡達到400g左右； 5月齡達到體成熟; 2．體溫調(diào)節(jié)差： 3．紅細胞少： 豚鼠紅細胞、血紅蛋白和紅細胞壓積比其他嚙齒類實驗動物低。,4．不能合成維生素C 體內(nèi)缺乏左旋葡萄糖內(nèi)酯氧化酶。5．有速發(fā)型和遲發(fā)型超敏反應：6．呼吸系統(tǒng)和消化系統(tǒng)抗病能力較差：7. 豚鼠對麻醉藥物也很敏感，故麻醉死亡率較高，患病豚鼠對麻醉藥更為敏感。,在生物醫(yī)

16、學研究中的應用,（一）免疫學研究1．提取補體: 免疫學實驗所用的補體多數(shù)用豚鼠血清制備，豚鼠血清中補體含量最豐富。2．過敏反應: 豚鼠是進行過敏性休克和變態(tài)反應研究的理想動物模型，特別是遲發(fā)型超敏反應性與人相似，最適合進行這方面的研究。 實驗動物對致敏原的敏感程度，從高到低依次為：豚鼠＞兔＞犬＞小鼠＞貓。3．皮膚刺激試驗: 豚鼠皮膚對毒物刺激反應靈敏，其反應近似人類，常用作局部皮膚毒物作用的

17、試驗，如研究化妝品和外用藥品對局部皮膚的刺激反應。,（二）藥物研究1．平喘藥研究: 組織胺能誘發(fā)豚鼠支氣管痙攣性哮喘模型。2．鎮(zhèn)咳藥研究: 吸入氨氣、二氧化硫、檸檬酸能引起豚鼠咳嗽.3．局部麻醉藥研究: 豚鼠常用于對局部麻醉藥的藥效評價。,（三）傳染病學研究 豚鼠對結(jié)核桿菌、白喉桿菌、鼠疫桿菌、鉤端螺旋體、霍亂弧菌、布氏桿菌和沙門氏菌等病原體十分敏感，尤其對結(jié)核桿菌高度敏感，感染后的病變與人的病

18、變類似。 研究支原體感染后的病理及細胞免疫變化常用幼齡豚鼠。,,家兔,豚鼠,家兔,實驗動物的選擇,物種：①盡量選擇對化合物毒性反應與人近似的動物②易于飼養(yǎng)管理，試驗操作方便；③易于獲得且價格較低的動物； ④品系純化，繁殖力較強；⑤為了有利于預測化合物對人的危害，要求選擇兩種以上的實驗動物，最好一種為嚙齒類，一種為非嚙齒類，分別求出其急性毒性參數(shù)。,3R原則：,減少(reduction)：在滿足實驗要求又不損失應得信

19、息的前提下，盡可能減少實驗動物的數(shù)量。優(yōu)化(refinement)：在動物實驗時，盡可能改良實驗操作技術(shù)，減輕動物可能遭受的痛苦。替代(replacement)：體外細胞和組織培養(yǎng)替代整體動物實驗。,2、級別：為保證實驗結(jié)果的可靠，一般選擇清潔級（Ⅱ級）或以上的動物,35,實驗動物的選擇,普通級（CV）：不攜帶主要人畜共患病原和烈性傳染??； 清潔級（CL）：除無上述病原，不攜帶對動物危害大和對研究干擾大的病原； 無特定病原體動

20、物（SPF）：除無上兩個病原，不攜帶主要潛在感染或條件治病和對科學研究干擾大的病原； 無菌動物（GF）：無可檢出的一切生命體。,年齡：剛成年，未曾交配和受孕的動物體重：大鼠180～240g、 小鼠18～25g、 家兔2～2.5kg、 豚鼠200～250g注意：同一次試驗同一批實驗動物體重變異范圍不應超過平均體重的20%,3.年齡與體重,4.性別:,雌雄各半

21、 特殊的試驗研究可僅作單一性別的毒性試驗雌雄各半，即每個劑量組兩性動物數(shù)相等。有性別差異時應單獨求出雌性和雄性的LD50；如是為致畸試驗作用準備，也可僅作雌性動物的LD50測試。,實驗動物的選擇,動物數(shù)量與隨機分組：①  數(shù)量：大鼠、小鼠等小動物數(shù)量為每組10只，狗等大動物應每組6只。②  隨機分組，提高每組動物間的均衡性。,實驗動物的選擇,禁食　經(jīng)口染毒的試驗，要求：大鼠、小鼠隔夜禁

22、食；大動物在染毒前不喂食，染毒后應繼續(xù)禁食3~4小時。,模擬人類在生活和生產(chǎn)環(huán)境中實際接觸途徑和方式。,(二) 染毒途徑的選擇,原則：,染毒途徑,經(jīng)消化道染毒,經(jīng)呼吸道染毒,經(jīng)皮膚染毒,注射途徑,,灌胃法（常用）喂飼法 吞咽膠囊法,1.經(jīng)消化道染毒,灌胃法①方法 將液態(tài)受試化合物或固態(tài)、氣態(tài)化合物溶于某種溶劑中，配制成一定濃度，裝入注射器等定量容器，經(jīng)過導管注入胃內(nèi)。②注意 a 灌胃容量不宜過大或過小 ，

23、 b 一般在動物空腹時進行。優(yōu)點：劑量準確缺點：工作量大,小鼠 0.1/10g大鼠 1ml/100g家兔 <5ml/kg狗 <50ml/kg,灌胃法,一是要保持小鼠的頭部和頸部成一直線，方便灌胃針頭進入，二是動作要輕柔，從口角進入，防止損失食道。灌胃針頭從小鼠的嘴角進入，壓住舌頭，抵住上顎，輕輕向內(nèi)推進，進入食管后會有一個刺空感，進入食道后就可以推注藥液了。,喂飼法 方法 將毒物摻入飼料或飲水中供

24、實驗動物食入或飲用優(yōu)點 ：動物自行食用，符合自然條件毒物應符合的條件：能與食物或水均勻混合；不與食物成分發(fā)生化學變化；不影響食物的氣味、顏色；不揮發(fā)；不破壞食物的營養(yǎng)成分,吞咽膠囊法方法 將一定劑量受試化合物裝入藥用膠囊內(nèi)，強制放到動物的舌后咽部迫使動物咽下。優(yōu)點 ①劑量準確:此種方式劑量準確，尤其適用于易揮發(fā)、易水解和有異味的化合物。 ②家兔及貓、狗等大動物可用此法。,靜式染毒動式染毒,2.經(jīng)呼吸道

25、染毒,靜式染毒,密閉在容器內(nèi)形成所需要的受試化合物濃度的空氣環(huán)境,靜式染毒 ① 方法 實驗動物置于一個有一定體積的密閉容器內(nèi)，加入定量的易揮發(fā)的液態(tài)化合物或一定體積的氣態(tài)化合物，在容器內(nèi)形成所需要的受試化合物濃度的空氣環(huán)境。② 優(yōu)點 設(shè)備簡單、操作方便、消耗受試化合物較少；尤其是適用于小動物接觸易揮發(fā)液態(tài)化合物的急性毒性研究。③ 缺點 容積有限，不能滿足較多動物及長時間持續(xù)染毒實驗的需氧氣量，且毒物的濃度隨時間的延長而逐漸下降,

26、動式染毒,空氣流動的染毒柜新鮮空氣補入系統(tǒng)含受試化合物空氣排出系統(tǒng)隨時補充受試化合物的配氣系統(tǒng),動式染毒 ①方法 實驗動物處于空氣流動的染毒柜中，染毒柜裝置備有新鮮空氣補入與含受試化合物空氣排出的動力系統(tǒng)和隨時補充受試化合物的配氣系統(tǒng)。②優(yōu)點 毒物濃度相對穩(wěn)定，動物有足夠的氧供，特別適于低濃度、長時間的慢性吸入染毒及大動物急性吸入染毒③缺點 設(shè)備較貴，操作較復雜，耗費毒物量較多,動物選擇：家兔和豚鼠部位：背部皮膚 方法

27、：定性試驗：浸尾法 皮膚定量染毒,3.經(jīng)皮膚染毒,,皮膚染毒,經(jīng)皮膚吸收 研究外來化合物經(jīng)皮膚吸收應當盡量選擇皮膚解剖、生理與人類較近似的動物為對象，目前多選用家兔和豚鼠。 但由于研究化合物經(jīng)皮膚吸收的毒性(求經(jīng)皮LD50)所需的實驗動物較多，使用家兔、豚鼠不夠經(jīng)濟，也常用大鼠代替。,皮膚染毒,定性試驗：為考察一個外來化合物能否經(jīng)皮吸收引起中毒，可先進行定性試驗。小

28、鼠或大鼠的浸尾試驗是常用的定性試驗方法。 定量試驗：是在實驗動物已脫好毛的部位定量涂布受試化合物，以求該化合物經(jīng)皮吸收的劑量－反應關(guān)系，求經(jīng)皮LD50。,皮膚染毒,局部刺激試驗 不少外來化合物可以引起皮膚接觸部位的局部損傷。研究化合物局部毒性作用常用皮膚斑貼法或兔耳法。,4.注射染毒,靜脈注射 肌肉注射 腹腔注射 皮下注射 皮內(nèi)注射,吸收速率：靜脈注射>肌肉注射>腹腔注射>皮下注射>消化道&g

29、t;皮內(nèi)注射>經(jīng)皮,預試驗劑量的設(shè)計：有相關(guān)資料可供參考者無相關(guān)資料可供參考者,57,染毒劑量與分組,58,預試驗劑量的設(shè)計,有相關(guān)資料參考,無相關(guān)資料參考,查閱文獻資料，找出與受試化學物質(zhì)結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)近似的化學物質(zhì)的毒性資料以文獻資料中相同的動物種系和相同接觸途徑所得的LD50值作為受試化學物質(zhì)的預期毒性中值。設(shè)定以此預期值作為待測化學物質(zhì)的中間劑量，并在該劑量的上下各設(shè)1～2個劑量組作為預試驗劑量。 如果沒有相同染毒

30、途徑或沒有相同種屬動物的毒性資料，也可參考其他染毒途徑或相近種屬動物的毒性資料。,59,預試驗劑量的設(shè)計,有相關(guān)資料參考,無相關(guān)資料參考,預試驗以1mg/kg為最低劑量組，以4倍為劑量組距，其他劑量組為4mg/kg、16mg/kg、64mg/kg和256mg/kg體重。若預試驗表明待測化學物質(zhì)的致死劑量范圍較窄，組距可縮小。當經(jīng)預試驗表明待測化學物質(zhì)毒性很大或很小時，最低劑量組可以下調(diào)或上調(diào)，再依以上原則進行再次預試驗。,對于毒性很

31、小的化學物質(zhì)，如食品、日用化學品進行毒性鑒定時，可直接作最大耐受量試驗（limit test）?？梢罁?jù)各類化學物質(zhì)的急性毒性分級標準，以最大耐受量作為試驗劑量，如經(jīng)口途徑為5g/kg體重, 經(jīng)皮為2g/kg體重，經(jīng)呼吸道為5mg/L。,60,染毒劑量與分組,LD50 的計算方法,霍恩法改進寇氏法序貫法Bliss法,霍恩（Horn)法,原理：利用劑量對數(shù)與死亡率（反應率）的轉(zhuǎn)換數(shù)（即幾率單位）呈直線關(guān)系而設(shè)計的方法，又稱平均移動法或

32、劑量遞增法,設(shè) 計 原 則 4個劑量組； 每組動物數(shù)相等； 每組4只或5只； 設(shè)計劑量時可根據(jù)化學物致死劑量范圍的寬窄應用兩個劑量系列，其組距分別為2.15倍和3.16倍。 根據(jù)每組動物數(shù)、組距和每組動物死亡數(shù)，即可從Horn氏表中查得LD50及其95％可信限。,霍恩（Horn)法,舉例：對某有機磷農(nóng)藥作經(jīng)口急性毒性試驗。將Wi

33、star大鼠隨機分為四組，每組4只。各組的給藥劑量分別為：464mg/kg,1000mg/kg,2150mg/kg,4640mg/kg，試驗觀察結(jié)束后各組的死亡數(shù)為：3只、1只、1只、4只。查表求LD50值及其可信限。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,霍恩（Horn)法,優(yōu)點：簡便，使用動物數(shù)少缺點：求得的95%可信限范圍大，不夠精確。 使用動物數(shù)少； 可直接從Horn氏表查出L

34、D50及其95％可信限，不需計算，甚為簡便。 LD50的95％可信區(qū)間范圍較大，方法精確度尚不夠。,改進寇氏法,原理：利用劑量對數(shù)與死亡率呈S形曲線而設(shè)計的方法，又稱Karber法或平均致死量法 方法：要求每個染毒劑量組動物數(shù)相等，各劑量組組距呈等比級數(shù)，死亡率呈正態(tài)分布，最低劑量組死亡率＜20%，最高劑量組死亡率＞80%。,改進寇氏法,計算公式為：,m=XK－i(　　-0.5),?m=i,注：m—lgLD50　　i—

35、相鄰兩劑量組對數(shù)劑量差即組距　　XK—最大劑量組對數(shù)劑量　　　—各劑量組死亡率總和　　?m—lgLD50的標準差　　p—死亡率　　q—存活率即q=1－p,改進寇氏法,舉例：小鼠經(jīng)口給予某種化學毒物染毒，劑量和死亡動物數(shù)結(jié)果見表,改進寇氏法,按式計算得：lgLD50=1.4961-0.08(2.3-0.5) =1.3521

36、 ?m =0.08(0.16/10+0.25/10+0.21/10+0.09/10)1/2 =0.0213lgLD50及其95%可信限為1.3521±1.96×0.0213＝1.3521 ±0.0417所以lgLD50及其95%可信限為22.50mg/kg(20

37、.44~24.76mg/kg),序貫法,原理：利用序貫設(shè)計原理，先以一個劑量進行試驗，如動物死亡，則以下一個小劑量試探，若仍死亡則以更小劑量試探；如動物存活，則以較大劑量試探，依次類推，最終求出LD50。優(yōu)點：很節(jié)省動物，一般12到14只動物即可完成試驗缺點：只適用于動物快速發(fā)生中毒反應及死亡的化學毒物，凡引起遲發(fā)死亡的化學物不適用。,序貫法,計算公式：　　LD50=(1/n)Σxf s={[nΣx2

38、f-(Σxf)2]/[n2(n-1)]}1/2式中：n---使用動物總數(shù)　　　x---每個劑量組的劑量　　　f----每個劑量組使用動物數(shù),序貫法,舉例：小鼠經(jīng)口給予某化學毒物染毒，以10mg/kg劑量試探，預計使用4個劑量組，劑量組組距為對數(shù)值0.2（即1.58倍），設(shè)計使用12只小鼠。結(jié)果見表：,序貫法,序貫法,LD50=(1/12) ×113.25=9.44(mg/kg)S={(13308-12825.56)

39、/[144（12－1)]}1/2 =0.55(mg/kg)LD50的95%可信限＝9.44±1.96 ×0.55＝9.44 ±1.07（mg/kg)因此該化合物小鼠經(jīng)口LD50及其95%可信區(qū)間范圍為9.44mg/kg(8.37~10.51mg/kg),Bliss法,又稱最大似然性法(maximum likelihood method)，被認為是最精確的LD50計算方法。我國《新藥臨床前毒理學研究指

40、導原則》及《新藥（西藥）毒理技術(shù)要求規(guī)范》均推薦此法。Bliss法試驗設(shè)計要求不是太嚴格，但該法計算復雜，現(xiàn)多利用計算機軟件進行運算。,88,全面觀察動物的各種反應和變化，仔細分析實驗動物在染毒后出現(xiàn)的中毒表現(xiàn)、劑量效應、時間分布。,觀察記錄的內(nèi)容：中毒癥狀及發(fā)生過程死亡情況及時間分布體重病理檢查,毒性觀察,89,1.中毒癥狀及發(fā)生過程,詳細觀察和記錄動物出現(xiàn)的中毒體征 發(fā)生時間 體征發(fā)展的經(jīng)過,各個系統(tǒng)的特征初步確定急性

41、毒性靶器官不同表現(xiàn)提供毒性機制的信息,,,,續(xù)表6-1 嚙齒類動物急性中毒表現(xiàn),,,,,,92,２．死亡情況和時間分布,實驗動物的死亡數(shù)對LD50值產(chǎn)生明顯影響分析中毒死亡時間的分布規(guī)律可以提供重要信息 ：原形，代謝,93,３．體重,反映動物中毒后綜合性整體變化，比較客觀簡便的量化指標應定期多次稱量動物的體重變化，一般為每周1次或2次對體重指標的變化要仔細觀察和分析,94,體重變化的原因,影響食欲或消化系統(tǒng)的功能影響食物的吸

42、收和利用影響水的攝取,95,４．病理檢查,死亡動物：大體病理變化，如臟器外觀、大小、色澤的變化，有無充血、出血、水腫或其他改變；存活動物：觀察期結(jié)束時亦應進行解剖檢查，必要時做組織病理學檢查。,96,觀察時間和周期,染毒以后應即刻開始觀察動物中毒表現(xiàn)和死亡情況給藥當天應連續(xù)或多次觀察，以后可根據(jù)情況，每天2次或多次觀察直至試驗周期結(jié)束,97,觀察周期一般為14天LD50(LC50)計算時以觀察周期內(nèi)各組動物的總死亡數(shù)為依據(jù)不同

43、化學物質(zhì)引起動物死亡的時間存在個體差異速殺型化學毒物僅計算24h的死亡率,觀察時間和周期,98,按照急性毒性分級標準評價毒性大小是相對粗略的分級報告：LD50、急性毒性級別；中毒體征、出現(xiàn)體征時間、死亡前征兆、死亡時間和劑量組間分布、存活動物的體重變化和恢復情況、死亡動物的病理變化,急性毒性分級和評價,為了評價化學毒物急性毒性的強弱及其對人類的潛在危害程度，當前各國都對照相應的急性毒性分級（acute toxicity classi

44、fication)標準來評價化學毒物的急性毒性?，F(xiàn)行的各種急性毒性的分級標準均是以LD50值為基礎(chǔ)劃分的，而各國際組織以及不同的國家都制定了各自的分級標準，至今尚未統(tǒng)一。,100,,,表6-2 外源化學物急性毒性分級（WHO）,101,表6-3 我國農(nóng)藥的急性毒性分級（GB15670-1995）,消耗的動物量大；獲得的信息有限；測得的LD50僅僅是一個近似值，95%可信區(qū)間較寬；在安全性評價中僅評價動物死亡和簡單的癥狀觀察是不夠

45、的，更需要的是生理學、血液學及其它化驗檢查所提供的深入細致的毒性信息。,102,經(jīng)典急性毒性試驗的局限性,,,鼠藥中毒,,,,,,復旦投毒案，      指2013年4月上海復旦大學上海醫(yī)學院研究生黃洋遭他人投毒后死亡的案件。犯罪嫌疑人林森浩是受害人黃洋的室友，投毒藥品為劇毒化學品N-二甲基亞硝胺?！-二甲基亞硝胺，淺黃色油狀液體。易溶于水、醇、醚，遇熱分解放出氮氧化物，可

46、致中毒。用于醫(yī)藥及食品分析研究。攝入、吸入或經(jīng)皮膚吸收可能致死，接觸可引起肝、腎損害?？稍趯嶒瀯游镏腥藶橹圃旄螕p傷的模型。較小劑量的長期暴露也可能增加肝癌風險。,復旦大學投毒案,黃洋，男，27歲，生于1985年，四川自貢人。復旦大學醫(yī)學院2010級在讀研究生。2013年4月16日，經(jīng)搶救無效，于當天下午3點23分在上海中山醫(yī)院去世?！〔痪们霸诙茄屎砜撇┦夸浫】荚囍腥〉玫谝幻?，剛剛獲得直升博士生機會?！碜运拇ㄐ】h城，父母下崗，母

47、親體弱多病，家里欠下了大筆錢。 曾因此欲放棄學業(yè)。,,據(jù)新華社最新消息，上海警方19日向記者證實，警方初步查明，林某因生活瑣事與黃某關(guān)系不和，心存不滿，經(jīng)事先預謀，3月31日中午，將其做實驗后剩余并存放在實驗室內(nèi)的劇毒化合物帶至寢室，注入飲水機槽。4月1日晨，黃某飲用飲水機中的水后出現(xiàn)中毒癥狀，后經(jīng)送醫(yī)救治無效于4月16日下午去世。,,,2015年1月8日上午，上海市高級人民法院將于對被告人林森浩故意殺人上訴一案進行公開宣判,森浩投毒案

48、二審維持原判：因故意殺人罪被判死刑,,,南京湯山特大投毒案,2002年9月14日，南京湯山發(fā)生一起特大投毒案。犯罪分子陳正平潛入“正武”面食店，將所攜帶的劇毒鼠藥“毒鼠強”投放到該店食品原料內(nèi)，造成395人因食用有毒食品而中毒，死亡42人。,14日上午開店之后，學生、工人、軍人陸續(xù)發(fā)生嘔吐、吐血的癥狀,114,2002年9月14日上午，南京市江寧區(qū)湯山鎮(zhèn)發(fā)生嚴重食物中毒事件。作廠中學和東湖麗島工地部分學生和民工因食用了油條、燒餅、麻團等

49、食物后發(fā)生中毒，陸續(xù)有多人死亡。南京湯山中毒事件是人為投毒案，經(jīng)警方78小時連續(xù)奮戰(zhàn)，犯罪嫌疑人陳正平被抓獲歸案。　　陳正平系南京浦口區(qū)橋林鎮(zhèn)人，在湯山鎮(zhèn)開了一家小吃店，因生意競爭，心懷恨意，用國家明令禁止的劇毒滅鼠藥“毒鼠強”進行投毒犯罪。至9月30日，該案已致42人死亡，300多人中毒。經(jīng)江蘇省高級人民法院核準，陳正平2002年10月14日上午在南京市被執(zhí)行死刑。,,第三節(jié) 局部毒性作用,,,眼刺激試驗皮膚刺激試驗皮膚變

50、態(tài)反應試驗,第四節(jié) 短期、亞慢性和慢性毒性作用,,一、蓄積毒性作用,基本概念,★蓄積作用（accumulation） ：外來化合物一次性進入機體之后，可經(jīng)代謝或原型排出體外，但當化合物與機體發(fā)生亞慢性接觸，將反復進入機體，而且當進入的速度或總量超過代謝轉(zhuǎn)化與排出的速度或總量時，化合物或其代謝產(chǎn)物就有可能在機體內(nèi)逐漸增加并貯留于某些部位，這種現(xiàn)象稱為化合物的蓄積作用。,蓄積作用的分類,★物質(zhì)蓄積（material accumulatio

51、n）實驗動物多次、反復接觸外來化合物一定時間后，用化學分析方法能夠測得機體內(nèi)或某些組織臟器內(nèi)存在該化合物或其代謝產(chǎn)物。如機體生物材料（血、尿等）檢定重金屬鉛、鎘、錳、汞含量升高 。,蓄積作用的分類,★功能蓄積（functional accumulation）有的化合物在機體內(nèi)雖不能被測出，卻在長期接觸下出現(xiàn)了慢性中毒現(xiàn)象，此時習慣上稱之為功能(機能)蓄積。,功能蓄積可能是由于貯存體內(nèi)的化合物或其代謝產(chǎn)物的數(shù)量極微，用目前的分析方法尚不

52、能檢出，（這時功能蓄積可視為一種特殊的物質(zhì)蓄積），或者是由于每次機體接觸化合物之后所引起的損害效應累積所致。 二者的劃分是相對的，它們同時存在，互為基礎(chǔ)，難以嚴格區(qū)分。,蓄積作用的研究意義,化學毒物的蓄積作用是發(fā)生慢性中毒的基礎(chǔ)，因此研究化學毒物的蓄積性是評價化學毒物能否引起潛在慢性毒性的依據(jù)之一，也是衛(wèi)生標準制定過程選擇安全系數(shù)的主要依據(jù)。,理化方法,124,蓄積作用--研究方法,利用化學分析或同位素技術(shù)測定毒物進入機體后，在體內(nèi)

53、含量變化的過程 ；,將多次染毒與一次染毒所產(chǎn)生的效應進行比較。,生物學方法,指實驗動物或人連續(xù)接觸外源化學物4w（28天）內(nèi)所產(chǎn)生的毒效應。目的：初步評價受試物的安全性，為亞慢性和慢性毒性試驗選擇劑量、觀察指標、毒性終點等提供依據(jù)。,125,二、短期毒性作用,亞慢性毒性（subchronic toxicity）：指人或?qū)嶒瀯游镞B續(xù)接觸較長時間、較大劑量的外源性化學物質(zhì)所出現(xiàn)的中毒效應。 慢性毒性（chronic toxicity）：

54、指人或?qū)嶒瀯游镩L期（甚至終生）反復接觸低劑量的外源性化學物質(zhì)所出現(xiàn)的毒性效應。,126,三、亞慢性和慢性毒性作用,亞慢性毒性試驗的目的： (1)研究受試物亞慢性毒性劑量-反應關(guān)系，確定LOAEL有害作用最低劑量和（或）NOAEL最大無作用劑量，為提出該化學物質(zhì)安全限量標準提供依據(jù)，同時也為慢性毒性試驗和致癌試驗的劑量設(shè)計提供依據(jù)。 (2)了解受試物亞慢性毒性的性質(zhì)、特點和靶器官，并為慢性毒性試驗觀察指標的選擇提供依據(jù)。,127,（一

55、）試驗目的,慢性毒性試驗的目的： （1）確定慢性毒性的參數(shù)：LOAEL和（或）NOAEL。 （2）闡明外源性化學物質(zhì)毒作用的性質(zhì)、靶器官和中毒機制。 （3）為制定該化學物質(zhì)的人類接觸的安全限量標準及進行危險度評定提供毒理學依據(jù)。,128,（一）試驗目的,129,（二）試驗設(shè)計,亞慢性毒性試驗設(shè)計慢性毒性試驗設(shè)計亞慢性、慢性毒性評價,1．實驗動物2．染毒途徑和染毒期限3．劑量選擇和分組 4. 觀察指標的選擇,130,

56、亞慢性毒性試驗設(shè)計,種屬：對外源性化學物質(zhì)的代謝過程、生理反應和生化特性基本上與人接近，而且在急性毒性試驗中證明是對受試物敏感的物種和品系。一般要求選擇兩個動物種屬：即嚙齒類如大鼠、家兔和非嚙齒類如狗、猴等，以全面了解外源性化學物質(zhì)的毒性特征。,131,1.實驗動物,性別：雌雄各半，但在一些特殊研究中也可以使用一種性別的動物，如研究性腺毒性或生殖毒性。年齡和體重：同組動物體重相差不超過平均體重的10%，組間平均體重不超過平均體重的5%

57、。小鼠15g左右，大鼠100g左右（嚙齒類動物不超過6周），狗8～12月齡。,132,1.實驗動物,動物數(shù)量：各實驗組及對照組動物數(shù)應相等或相近，小動物≥20只/組，大動物≥6只/組。如試驗要求在試驗中期處死部分動物進行病理學檢查，則每組動物數(shù)要相應增加。,133,1.實驗動物,染毒途徑：應盡量采用人群實際接觸的途徑和方式，并與預期進行慢性毒性試驗的接觸途徑相一致。一般以經(jīng)口、經(jīng)呼吸道和經(jīng)皮染毒三種途徑為多。染毒時間：呼吸道染毒：2-

58、6h/d，工業(yè)毒物可以縮短至1h或延長，環(huán)境污染物可延長至8h。經(jīng)皮染毒： 6h/d ，每周應對染毒部位脫毛一次。染毒期限：對于不同壽命的實驗動物，染毒期限的長短也不同。一般對大、小鼠而言，染毒期限不超過3個月。,134,2.染毒途徑和期限,設(shè)3個劑量組和1個陰性對照組；劑量效應要求： 高劑量組：引起較為明顯的中毒癥狀或是某項觀察指標發(fā)生明顯的改變，但不引起動物死亡，即使有死亡，也應小于動物數(shù)的10%； 中劑量組：應為觀察到

59、較輕微中毒癥狀，相當于有害作用的最低劑量（LOAEL）； 低劑量組：無中毒反應或只觀察到極輕微的反應，相當于亞慢性的閾劑量或最大無作用劑量（NOAEL）水平。,135,3.劑量設(shè)計和分組,劑量：最高劑量的確定: ①以急性閾劑量為該受試物的最高劑量；②以該受試物的1/20～1/5 LD50為最高劑量組。劑量組距以3～5倍為宜，最低不小于2倍。,136,3.劑量設(shè)計和分組,農(nóng)藥、食品添加劑、工業(yè)化學品和其他非藥用化學物試驗劑量選

60、擇的基本原則有很多相似之處，但由于各自具有專業(yè)特殊性以及管理部門的不同，均有各自不同的劑量設(shè)計規(guī)范要求。,137,3.劑量設(shè)計和分組,一般性指標特異性指標,138,4.觀察指標,外觀體征和行為活動、糞便性狀、食量及體重變化等，常常能綜合反映毒物對機體的毒作用，往往是敏感的綜合毒效應指標。應詳細記錄，仔細分析，從中發(fā)現(xiàn)化學毒物的毒性特征。,139,一般性指標,140,一般性指標,(1)外觀體征、行為活動 每日觀察外觀體征

61、和行為改變，記錄時間和先后次序，包括食欲、活動、被毛、分泌物、排泄物、呼吸等；留意動物被毛的光潔度與色澤、眼分泌物、呼吸、神態(tài)、行為等。 有助于分析化學毒物損害機體的部位及程度。,(2)動物體重：①反映動物健康狀況的最基本的靈敏指標之一,反映了受試物對實驗動物的生長發(fā)育及一般狀態(tài)的影響。②表示體重變化的指標: a.體重 b.體重增長百分率,141,一般性指標,(2)動物體重：③提示有毒效應：試驗組體重比對照組

62、低10％； 肯定是綜合毒效應：試驗組體重與對照組有顯著差異，且各試驗組呈劑量-反應關(guān)系。,142,一般性指標,(2)動物體重：④注意：對照組和各試驗組的喂飼條件一致，包括同一批動物、同樣的飼養(yǎng)條件，而且動物所處籠盒的位置、局部光照、溫度、濕度等各組間也應設(shè)法保持一致?！　　∫话忝恐芊Q重一次，3個月后也可每2周稱重一次。,143,一般性指標,(3)食物利用率①概念：指動物每食入100g飼料所增加的體重克數(shù)。以g體重/100g飼料表

63、示。,144,一般性指標,食物利用率(－)，體重↓或體重增長緩慢：受試物不適口，影響動物食欲；,②意義：　食物利用率↓，體重↓或體重增長緩慢：受試物干擾了食物的吸收代謝；,(4)實驗室檢查 血、尿等體液的實驗室檢查目的是發(fā)現(xiàn)受試物所致器官損傷和功能紊亂，體內(nèi)生化轉(zhuǎn)化和排泄的重要器官肝和腎的功能是檢查重點，血液是另一個重要的靶器官。,145,一般性指標,(4)實驗室檢查①血液學檢查：包括血紅蛋白濃度、血球壓積、紅

64、細胞計數(shù)、血小板數(shù)、白細胞計數(shù)與分類、凝血功能等指標。 ②血液生化檢查：總蛋白濃度、白蛋白濃度、肝功能試驗、糖代謝、腎功能等 。,146,一般性指標,采血量：不影響動物生理功能的最大采血量為其總血量的10％，總血量約為50ml/kg體重。,(4)實驗室檢查③尿液檢查：尿量、尿比重、蛋白、糖、潛血、沉淀物鏡檢等，可提供與毒物有關(guān)的靶器官毒性和中間代謝產(chǎn)物的信息。,147,一般性指標,（5）系統(tǒng)尸解和組織病理學檢查 試

65、驗結(jié)束時系統(tǒng)解剖，進行詳細的肉眼檢查，測定臟器重量并作組織病理學檢查。在試驗中間死亡或處于瀕死狀態(tài)的動物，亦應作及時的系統(tǒng)尸解和病理學檢查。,148,一般性指標,① 臟器系數(shù)概念：又稱臟/體比，指某個臟器的濕重與單位體重的比值，單位體重一般以100g體重計。如肝/體比，即（全肝濕重/體重)×100%。 適用于實質(zhì)性臟器。,149,一般性指標,意義： 增大：充血、水腫、腫瘤、增生 降低：壞

66、死、萎縮,,（5）系統(tǒng)尸解和組織病理學檢查②病理學檢查 大體檢查、常規(guī)組織病理學檢查、酶組織化學檢查、免疫組織化學檢查、細胞超微結(jié)構(gòu)檢查等，分別從大體、組織、細胞、亞細胞，甚至分子水平等多個方面發(fā)現(xiàn)化學毒物的毒效應。③參照急性毒性試驗的臟器改變或亞慢性中毒癥狀及其它生化陽性指標，可有重點地對某臟器組織進行檢查。,150,一般性指標,特異性指標往往是反映外源性化學物質(zhì)對機體毒作用本質(zhì)的指標，這些指標的測定有助于取得中毒機理

67、的線索。此類指標意義重大，但在中毒機理不明確的情況下往往難以選擇。 一般從分析受試物的化學結(jié)構(gòu)（如特殊基團）或分析受試物急性或亞急性毒性作用的特征時發(fā)現(xiàn)線索。,151,特異性指標,1．實驗動物2．染毒途徑和期限3．劑量設(shè)計和分組4. 觀察指標,152,慢性毒性試驗設(shè)計,種屬　嚙齒類首選大鼠，非嚙齒類動物選狗和猴。 數(shù)量　每組動物數(shù)無統(tǒng)一要求，以統(tǒng)計處理數(shù)據(jù)可靠為依據(jù)。一般大鼠40～60只，狗8～10只，雌雄各半。若需分

68、批處死或需觀察后作用時，每組動物數(shù)還須相應增多。 年齡體重　一般嚙齒類選初斷乳（小于6周齡）的大小鼠，小鼠10～15g,大鼠50～70g，狗<8月。,153,1.實驗動物,染毒途徑　實際工作中多采用經(jīng)胃腸道染毒、皮膚染毒和經(jīng)呼吸道染毒三種途徑。經(jīng)胃腸道染毒最好采用喂飼法，即將受試物與食物或飲水混勻。如果受試樣品的毒性較低，則加入飼料的受試樣品比例較大，應注意混入飼料中的受試樣品不應超過5%，否則會對動物正常營養(yǎng)產(chǎn)生影響。,1

69、54,2.染毒途徑與期限,染毒期限　應以受試物的具體要求和實驗動物的物種而定。工業(yè)毒物要求6個月或更長，環(huán)境毒物或食品添加劑則要求至少一年。若與致癌試驗結(jié)合進行，染毒期限最好接近或等于動物的壽命。 經(jīng)口染毒：1次/d，每周5～6d；經(jīng)呼吸道染毒：常模擬所研究的工業(yè)現(xiàn)場和環(huán)境場所，分間歇性吸入和連續(xù)性吸入，如工業(yè)毒物6～8h/d ，5d/周；環(huán)境毒物>8h/d，7d/周； 經(jīng)皮染毒：4～6h/d，5d/周。,155,