醫(yī)療器械的無(wú)菌和初始污染菌檢驗(yàn)

1、,,醫(yī)療器械無(wú)菌和初始污染菌檢驗(yàn)技術(shù),國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局北京醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心,,,醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)技術(shù),,什么是無(wú)菌檢查法？,用于檢查要求無(wú)菌的醫(yī)療器械是否無(wú)菌的一種方法。若供試品符合無(wú)菌檢查法的規(guī)定，僅表明了供試品在該檢驗(yàn)條件下未發(fā)現(xiàn)微生物污染。 無(wú)菌試驗(yàn)的目的：將醫(yī)療器械或其浸提液接種于培養(yǎng)基內(nèi)，以檢驗(yàn)供試品是否有細(xì)菌和真菌污染。,醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn),,GB/T 14233.2 -2005 醫(yī)用輸液、輸血、

2、注射器具檢驗(yàn)方法 第2部分：生物學(xué)試驗(yàn)方法2010年版《中國(guó)藥典》無(wú)菌檢查法,醫(yī)療器械無(wú)菌試驗(yàn)檢查要點(diǎn)指南（2010版）,,,無(wú)菌檢驗(yàn)是無(wú)菌醫(yī)療器械產(chǎn)品生產(chǎn)控制過(guò)程中的一項(xiàng)重要內(nèi)容。其檢驗(yàn)方法、檢驗(yàn)結(jié)果判定及檢驗(yàn)人員業(yè)務(wù)能力等因素直接影響產(chǎn)品的質(zhì)量和安全。作為無(wú)菌醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè)，其無(wú)菌檢驗(yàn)工作應(yīng)由本企業(yè)獨(dú)立完成。并要求企業(yè)的檢驗(yàn)人員能當(dāng)場(chǎng)操作或口述無(wú)菌檢驗(yàn)的過(guò)程。,,,,滅菌: 殺滅或除去特定環(huán)境或物品中一切微生物的過(guò)程。目前國(guó)

3、際上規(guī)定，滅菌過(guò)程必須使滅菌物品污染的微生物存活率減少到10-6及以下。 微生物: 必須用光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡才能觀察到的微小生物。微生物具有一定的形態(tài)與結(jié)構(gòu),并能在適宜的環(huán)境中迅速地生長(zhǎng)和繁殖,如細(xì)菌、病毒、真菌等。 無(wú)菌：是指某一物體或某一環(huán)境中不含有活的微生物。 無(wú)菌技術(shù):是指在微生物試驗(yàn)工作中，控制或防止各類(lèi)微生物的污染及其干擾的一系列操作方法和有關(guān)措施，其中包括無(wú)菌環(huán)境設(shè)施、無(wú)菌試驗(yàn)器材以及無(wú)菌操作。,,

4、,,無(wú)菌操作:是指在無(wú)菌環(huán)境條件下，在對(duì)無(wú)菌制品或無(wú)菌器械進(jìn)行檢驗(yàn)的過(guò)程中，能防止微生物污染與干擾的一種常規(guī)操作方法。 培養(yǎng)條件：用于促進(jìn)微生物發(fā)育、生長(zhǎng)和繁殖的生長(zhǎng)培養(yǎng)基和培養(yǎng)方式的組合。 抑細(xì)菌/抑霉菌試驗(yàn)：用選定的微生物來(lái)演示某些物質(zhì)的存在能夠抑制這些微生物的繁殖。 培養(yǎng)基: 是人工配制的生物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，即用人工的方法將多種物質(zhì)按各種微生物生長(zhǎng)繁殖的需要配成的一種混合營(yíng)養(yǎng)物。,,,,促生長(zhǎng)試驗(yàn)：用于證明生長(zhǎng)培養(yǎng)基

5、能夠支持微生物 生長(zhǎng)的技術(shù)操作。 假陰性：實(shí)際陽(yáng)性的無(wú)菌試驗(yàn)結(jié)果被變成了陰性。 假陽(yáng)性：實(shí)際陰性的無(wú)菌試驗(yàn)結(jié)果被變成了陽(yáng)性。 需氧菌：在代謝中，有氧條件下才能生存的微生物。 厭氧菌：在代謝中，沒(méi)有氧的條件下才能生存的微生物。 無(wú)菌保證水平（SAL）:滅菌后產(chǎn)品上存在單個(gè)活微生物的概率。,,,,細(xì)菌：為單細(xì)胞微生物,其細(xì)胞分化不完善，

6、無(wú)完整細(xì)胞核及核膜、核仁，直徑一般為1μm ~ 10μm。,,,,真菌：為多細(xì)胞或單細(xì)胞微生物，其細(xì)胞分化完善，有細(xì)胞核和各種細(xì)胞器，故易在體外生長(zhǎng)繁殖，直徑一般為10μm ~ 100μm。,醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)所需設(shè)備,,,超凈工作臺(tái),醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)所需設(shè)備,,,恒溫培養(yǎng)箱（至少2臺(tái)）,醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)所需設(shè)備,,,壓力蒸汽滅菌器,醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)所需設(shè)備,,,電熱干燥箱,醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)所需設(shè)備,集菌儀,,醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)所需設(shè)備,,

7、,生物安全柜:（從試驗(yàn)安全性考慮，建議陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)使用生物安全柜）,醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)所需設(shè)備,電子天平,,醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)所需設(shè)備,光學(xué)顯微鏡,,醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)所需設(shè)備,過(guò)濾裝置（無(wú)油真空泵、濾杯、濾頭、濾瓶、微孔濾膜、夾子）,,無(wú)菌檢查應(yīng)在環(huán)境潔凈度10 000級(jí)下的局部潔凈度100級(jí)的單向流空氣區(qū)域內(nèi)或隔離系統(tǒng)中進(jìn)行，其全過(guò)程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。單向流空氣區(qū)、工作臺(tái)面及

8、環(huán)境應(yīng)定期按《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測(cè)試方法》的現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行潔凈度驗(yàn)證。隔離系統(tǒng)按相關(guān)的要求進(jìn)行驗(yàn)證，其內(nèi)部環(huán)境的潔凈度須符合無(wú)菌檢查的要求。 無(wú)菌檢查人員必須具備微生物專(zhuān)業(yè)知識(shí)，并經(jīng)過(guò)無(wú)菌技術(shù)的培訓(xùn)。還應(yīng)該具有高度的責(zé)任心和嚴(yán)謹(jǐn)細(xì)致的工作作風(fēng)。,環(huán)境及人員要求,,,,,,,無(wú)菌檢查法 環(huán)境要求,,,,,隔離系統(tǒng),無(wú)菌檢查法 環(huán)境要求,,,,,無(wú)菌室在消毒處理完畢后，應(yīng)檢查空氣中的菌落數(shù)。,無(wú)

9、菌檢查法 環(huán)境要求,TSA瓊脂平皿在30℃~ 35℃培養(yǎng)48h證明無(wú)菌,取3只放無(wú)菌操作臺(tái)或超凈工作臺(tái)平均位置打開(kāi)上蓋，暴露30min后蓋好,3只培養(yǎng)皿上生長(zhǎng)的菌落數(shù)平均應(yīng)不超過(guò)1個(gè),無(wú)菌試驗(yàn)過(guò)程中也應(yīng)檢查空氣中的菌落數(shù)，方法要求同上,,,無(wú)菌檢查法 試驗(yàn)前準(zhǔn)備,,器具滅菌：與供試液接觸的所有器具應(yīng)采用可靠方法滅菌，置壓力蒸汽滅菌器內(nèi)121℃30min，或置電熱干燥箱內(nèi)160℃2h。 培養(yǎng)基：可按藥典中的處方制備培養(yǎng)基，

10、亦可使用按該處方生產(chǎn)的符合規(guī)定的脫水培養(yǎng)基。應(yīng)采用驗(yàn)證合格的滅菌程序滅菌。制備好的培養(yǎng)基應(yīng)保存在2 ℃ ~ 25℃，一般在3周內(nèi)使用。,無(wú)菌檢查法 試驗(yàn)前準(zhǔn)備,配制培養(yǎng)基所需器具:,,,,,,無(wú)菌檢查法 試驗(yàn)前準(zhǔn)備,常用器具與稀釋液:,,,,,,無(wú)菌檢查法 試驗(yàn)前準(zhǔn)備,培養(yǎng)基:,,,,,,無(wú)菌檢查法 試驗(yàn)前準(zhǔn)備,硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基: 在供試品接種前, 培養(yǎng)基氧化層的高度不得超過(guò)培養(yǎng)基深度的1/5，否則,須經(jīng)100℃

11、水浴加熱至粉紅色消失（不超過(guò)20分鐘）迅速冷卻,只限加熱一次，并應(yīng)防止被污染。其裝量與容器高度的比例應(yīng)符合培養(yǎng)結(jié)束后培養(yǎng)基氧化層（粉紅色）不超過(guò)培養(yǎng)基深度的 1/2。30℃ ~ 35℃培養(yǎng)14天。,,,,,,需氧菌生長(zhǎng),厭氧菌生長(zhǎng),,,無(wú)菌檢查法 試驗(yàn)前準(zhǔn)備,,,,,,,100℃水浴加熱,無(wú)菌檢查法 試驗(yàn)前準(zhǔn)備,培養(yǎng)基:,,,,,,無(wú)菌檢查法 試驗(yàn)前準(zhǔn)備,改良馬丁培養(yǎng)基： 23℃ ~ 28℃培養(yǎng)14天,,,,,,無(wú)菌檢查法 試

12、驗(yàn)前準(zhǔn)備,培養(yǎng)基:,,,,,,無(wú)菌檢查用的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基等應(yīng)符合培養(yǎng)基的無(wú)菌性檢查及靈敏度檢查的要求。        無(wú)菌性檢查    每批培養(yǎng)基隨機(jī)不少于5支（瓶），培養(yǎng)14天，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。,培養(yǎng)基的適用性檢查,,,,,,靈敏度檢查：     

13、;                                    &#

14、160;       菌種   培養(yǎng)基靈敏度檢查所用的菌株傳代次數(shù)不得超過(guò)5代（從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)，以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus   aureus)［CMCC（B） 26 003］ 銅綠假單胞菌&

15、#160;   (Pseudomonas  aeruginosa) ［CMCC（B） 10  104］ 枯草芽孢桿菌    (Bacillus  subtilis )             

16、60;  ［CMCC（B） 63  501］ 生孢梭菌         (Clostridiumsporogenes)            [CMCC(B)  

17、60;      64  941] 白色念珠菌       (Candidaalbicans)                 

18、      [CMCC(F)         98   001]　 黑曲霉           (Aspergillus   niger&

19、#160; )　　　　   [CMCC(F)         98   003],培養(yǎng)基的適用性檢查,,,,菌液制備：                

20、                                   接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單

21、胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中或營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，接種生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，30℃～35℃培養(yǎng)18小時(shí)～24小時(shí)；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基上，（23～28）℃培養(yǎng)（24～48）小時(shí)，上述培養(yǎng)物用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1mL 含菌數(shù)小于100cfu（菌落形成單位）的菌懸液。,培養(yǎng)基的適用性檢查,,,,,菌液制備：接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面

22、培養(yǎng)基上，（23～28）℃培養(yǎng)（5～7）天，加入（3～5）mL含0.05％（v/v）聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，用適宜的方法吸出孢子懸液至無(wú)菌試管內(nèi)，用含0.05％（v/v）聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1mL 含孢子數(shù)小于100cfu的孢子懸液。 菌懸液在室溫下放置應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)使用，若保存在（2～8）℃可在24小時(shí)內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可保存在（2～8）℃，在驗(yàn)證過(guò)的貯存期內(nèi)使

23、用 。,培養(yǎng)基的適用性檢查,,,,,平板劃線法-斜線法：用接種環(huán)以無(wú)菌操作挑取菌懸液一環(huán)，先在平板培養(yǎng)基的一邊作第一次平行劃線（3-4）條，再轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿70°角，并將接種環(huán)上剩余物燒掉，待冷卻后通過(guò)第一次劃線部分作第二次平行劃線，再用同法通過(guò)第二次平行劃線部分作第三次平行劃線和第四次平行劃線。,培養(yǎng)基的適用性檢查,,,,,,,平板劃線法-曲線法：將挑取有樣品的接種環(huán)在平板培養(yǎng)基上作連續(xù)劃線。,,培養(yǎng)基的適用性檢查,,,,,,血

24、瓊脂平板上的金黃色葡萄球菌（大的金黃色菌落）,在劃線過(guò)程中，細(xì)胞逐漸分散，培養(yǎng)后可形成單個(gè)菌落。,定期移植法:亦稱(chēng)傳代培養(yǎng)保藏法，指將菌種接種于適宜的斜面培養(yǎng)基上，最適條件下培養(yǎng)，完成培養(yǎng)于(4～6)℃進(jìn)行保存并間隔一定時(shí)間進(jìn)行移植培養(yǎng)的一種短期菌種保藏方法。 操作步驟： 斜面制備 接種 培養(yǎng) 保藏,培養(yǎng)基的適用性檢查,,,,,,,,,接 種,,,

25、,,,培養(yǎng)基應(yīng)符合無(wú)菌性檢查及靈敏度檢查的要求。檢查可在供試品的無(wú)菌檢查前或與供試品的無(wú)菌檢查同時(shí)進(jìn)行。,靈敏度檢查所用菌種（藥典2010版規(guī)定）金黃色葡萄球菌銅綠假單胞菌枯草芽孢桿菌生孢梭菌白色念珠菌黑曲霉,分別接種各菌種新鮮培養(yǎng)物至相應(yīng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將培養(yǎng)物用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成菌懸液（濃度小于100cfu/mL）,硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（12mL）9支：分別接種小于100cfu的金葡、銅綠、枯草、生孢各2支，

26、另一支不接種做空白對(duì)照，培養(yǎng)3天,改良馬丁培養(yǎng)基（9mL） 5支：分別接種小于100cfu的白念、黑曲霉各2支，另1支不接種做空白對(duì)照，培養(yǎng)5天,逐日觀察結(jié)果：空白對(duì)照管應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)，若加菌的培養(yǎng)基管均生長(zhǎng)良好，則靈敏度符合規(guī)定。,,,,,,,,培養(yǎng)基的適用性檢查,,,,,,對(duì)起始樣品進(jìn)行連續(xù)10倍稀釋?zhuān)瑢⒏呦♂尡稊?shù)的樣品與冷卻至適當(dāng)溫度的溶化瓊脂培養(yǎng)基倒入無(wú)菌平皿后混合均勻，培養(yǎng)后獲得單菌落。培養(yǎng)基表面菌落為圓形，而培養(yǎng)基內(nèi)部菌落呈豆

27、狀或透鏡狀。,,培養(yǎng)基的適用性檢查,,,,,,無(wú)菌檢驗(yàn)有兩種方法：直接接種法、薄膜過(guò)濾法直接接種法:將供試品或其有代表性的各部分直接投放入培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)。薄膜過(guò)濾法:含抗菌、抑菌成分的供試品會(huì)抑制某些微生物的生長(zhǎng)繁殖,所以用常規(guī)方法檢查會(huì)出現(xiàn)假陰性的結(jié)果, 但并不等于產(chǎn)品中沒(méi)有微生物甚至是致病性微生物。所以采用薄膜過(guò)濾法來(lái)去除供試品中可溶的抑菌性成分,把細(xì)菌等微生物截留在濾膜上,然后再經(jīng)過(guò)處理培養(yǎng)使所含微生物生長(zhǎng)繁殖, 從而使微生物檢

28、出。,方法驗(yàn)證試驗(yàn),,,,,,當(dāng)建立產(chǎn)品的無(wú)菌檢查法時(shí)，應(yīng)進(jìn)行方法的驗(yàn)證，以證明所采用的方法適合于該產(chǎn)品的無(wú)菌檢查。若產(chǎn)品的組分或原檢驗(yàn)條件發(fā)生改變時(shí)，檢查方法應(yīng)重新驗(yàn)證。      驗(yàn)證時(shí)，按“供試品的無(wú)菌檢查”的規(guī)定及下列要求進(jìn)行操作。對(duì)每一試驗(yàn)菌應(yīng)逐一進(jìn)行驗(yàn)證。,方法驗(yàn)證試驗(yàn),,,,,,菌種及菌液制備 ：除大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B)

29、4 4102〕外，金黃色葡萄球菌 、 枯草芽孢桿菌  、 生孢梭菌、 白色念珠菌、黑曲霉同培養(yǎng)基靈敏度檢查。大腸埃希菌的菌液制備同金黃色葡萄球菌。 方法驗(yàn)證試驗(yàn)與靈敏度檢驗(yàn)所有菌種區(qū)別：大腸埃希菌代替銅綠假單胞菌。,方法驗(yàn)證試驗(yàn),,,,,,取每種培養(yǎng)基規(guī)定接種的供試品總量按薄膜過(guò)濾法過(guò)濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入小于100cfu的試驗(yàn)菌，過(guò)濾。取出濾膜接種至硫

30、乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或改良馬丁培養(yǎng)基中，或?qū)⑴囵B(yǎng)基加至濾筒內(nèi)。另取一裝有同體積培養(yǎng)基的容器，加入等量試驗(yàn)菌，作為對(duì)照。按規(guī)定溫度培養(yǎng)3天~ 5天。各試驗(yàn)菌同法操作。,方法驗(yàn)證試驗(yàn)：薄膜過(guò)濾法,,,,,,,方法驗(yàn)證所用菌種（藥典2010版規(guī)定）金黃色葡萄球菌大腸埃希菌枯草芽孢桿菌生孢梭菌白色念珠菌黑曲霉,分別接種各菌種新鮮培養(yǎng)物至相應(yīng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將培養(yǎng)物用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成菌懸液（濃度小于100cfu/mL）,硫

31、乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基8支：分別接種小于100cfu的金葡、大腸、枯草、生孢各2支，其中1管接入每支培養(yǎng)基規(guī)定的供試品接種量，另1管作為對(duì)照，培養(yǎng)3天。,改良馬丁培養(yǎng)基4支：分別接種小于100cfu的白念、黑曲霉各2支，其中1管接入每支培養(yǎng)基規(guī)定的供試品接種量，另1管作為對(duì)照，培養(yǎng)5天。,,,,,,方法驗(yàn)證試驗(yàn)：直接接種法,與對(duì)照管比較，如含供試品各容器中的試驗(yàn)菌均生長(zhǎng)良好，則說(shuō)明供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下無(wú)抑菌作用或其抑菌作用可以忽略

32、不計(jì)，照此檢查法和檢查條件進(jìn)行供試品的無(wú)菌檢查。如含供試品的任一容器中微生物生長(zhǎng)微弱、緩慢或不生長(zhǎng)，則說(shuō)明供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下有抑菌作用，可采用增加沖洗量，或增加培養(yǎng)基的用量，或使用中和劑或更換濾膜品種等方法，消除供試品的抑菌作用，并重新進(jìn)行方法驗(yàn)證。    方法驗(yàn)證試驗(yàn)也可與供試品的無(wú)菌檢查同時(shí)進(jìn)行。,方法驗(yàn)證試驗(yàn)：結(jié)果判斷,,,,,,供試品數(shù)量的選擇： 檢驗(yàn)數(shù)量是指一次試驗(yàn)

33、所用供試品最小包裝容器的數(shù)量。一般情況下，供試品無(wú)菌檢查若采用薄膜過(guò)濾法，應(yīng)增加1/2的最小檢驗(yàn)數(shù)量作陽(yáng)性對(duì)照用；若采用直接接種法，應(yīng)增加供試品1 支（或瓶）作陽(yáng)性對(duì)照用。,供試品的無(wú)菌檢查,,,,檢驗(yàn)量是指一次試驗(yàn)所用的供試品總量（g或ml）。若每支（瓶）供試品的裝量按規(guī)定足夠接種兩份培養(yǎng)基，則應(yīng)分別接種硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基。采用薄膜過(guò)濾法時(shí)，檢驗(yàn)量應(yīng)不少于直接接種法的總接種量，只要供試品特性允許，應(yīng)將所有容器內(nèi)的全部

34、內(nèi)容物過(guò)濾。,供試品的無(wú)菌檢查,,,,供試品包裝須完好無(wú)損，尤其是只有一層包裝的樣品。進(jìn)入無(wú)菌檢驗(yàn)室的樣品若有兩層（或兩層以上）包裝的，需將外包裝在傳遞窗（或緩沖間）拆除后，傳入實(shí)驗(yàn)室。 操作人員準(zhǔn)備：帶口罩、帽子、穿專(zhuān)用無(wú)菌服、鞋進(jìn)入無(wú)菌室。,供試品的無(wú)菌檢查,,,,,供試品的無(wú)菌檢查,,,在100級(jí)超凈臺(tái)內(nèi)，酒精燈火焰周?chē)?，以無(wú)菌操作法將規(guī)定量的供試品分別接種至含硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（不少于15m

35、l/管）和改良馬丁培養(yǎng)基（不少于10ml/管）的容器中。 正確的無(wú)菌操作，既不能引入外來(lái)菌污染培養(yǎng)物造成假陽(yáng)性，也要注意接觸供試品的試驗(yàn)用具溫度不可過(guò)高以免將可能存在的菌燙死。,,陰性對(duì)照（目的是驗(yàn)證試驗(yàn)是否存在污染） ：供試品無(wú)菌檢查時(shí)，應(yīng)取相應(yīng)溶劑和稀釋液同法操作，作為陰性對(duì)照。陰性對(duì)照不得有菌生長(zhǎng)。陽(yáng)性對(duì)照（目的是驗(yàn)證試驗(yàn)可靠性，防止假陰性）：應(yīng)根據(jù)供試品特性選擇陽(yáng)性對(duì)照菌；無(wú)抑菌作用供試品以金黃色葡萄球菌為陽(yáng)性對(duì)照菌。

36、陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)的菌液制備同方法驗(yàn)證試驗(yàn)，加菌量小于100cfu，供試品用量同供試品無(wú)菌檢查每份培養(yǎng)基接種的樣品量。陽(yáng)性對(duì)照管培養(yǎng)(48 ~ 72)小時(shí)應(yīng)生長(zhǎng)良好。,供試品的無(wú)菌檢查,,,,,,無(wú)菌檢查法-直接接種法,,供試品數(shù)量：同一批號(hào)3個(gè)~ 11個(gè)單位供試品 優(yōu)先采用將供試品或其有代表性的各部分直接投放入培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)。如：棉簽、導(dǎo)尿包中的導(dǎo)尿管、注射器中的液體等,無(wú)菌檢查法 –直接接種法,,不適宜直接投放的可制備供試液：

37、浸提介質(zhì)：9g/L無(wú)菌氯化鈉溶液（生理鹽水）、0.1%蛋白胨水溶液、pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液 、根據(jù)供試品的特性，可選用其他驗(yàn)證過(guò)的適宜的溶液作為稀釋液、沖洗液。管類(lèi)器具： 按管內(nèi)表面積每10cm2流過(guò)管內(nèi)腔1mL浸提介質(zhì)，流量約為10mL/min。容器類(lèi)器具： 已有液體的直接取液；空容器每10cm2加入浸提介質(zhì)1mL，振搖數(shù)次。實(shí)體類(lèi)器具：表面積每10cm2加入浸提介質(zhì)1mL，振搖數(shù)次。

38、 供試液制備應(yīng)按無(wú)菌操作法進(jìn)行，在制備后2h內(nèi)使用。,無(wú)菌檢查法 –直接接種法,直接接種法：每個(gè)供試品按規(guī)定量分別接種至各含硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基的容器中。除另有規(guī)定外，每個(gè)容器中培養(yǎng)基的用量應(yīng)符合接種的供試品體積不得大于培養(yǎng)基體積的10%，同時(shí)，硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基每管裝量不少于15mL，改良馬丁培養(yǎng)基每管裝量不少于10mL。,,,無(wú)菌檢查法-薄膜過(guò)濾法,2010年版《中國(guó)藥典》規(guī)定:只要供試品性狀允許，應(yīng)采用薄

39、膜過(guò)濾法。供試品無(wú)菌檢查所采用的檢查方法和檢驗(yàn)條件應(yīng)與驗(yàn)證的方法相同。 在蠕動(dòng)泵的作用下，被測(cè)產(chǎn)品通過(guò)裝有帶空氣過(guò)濾器的針頭及無(wú)菌管路直接從樣品容器中進(jìn)入濾筒中，免去了通常膜轉(zhuǎn)移過(guò)程中易產(chǎn)生的污染。 無(wú)菌檢查法中薄膜過(guò)濾法所用的濾膜孔徑應(yīng)不大于0.45μm，直徑約為50mm。,,水溶液供試品,取規(guī)定量的供試液，直接過(guò)濾，或混合至含適量稀釋液的無(wú)菌容器內(nèi)，混勻，立即過(guò)濾。,供試液經(jīng)薄膜過(guò)濾后，若需要用沖洗液沖洗濾

40、膜，每張濾膜每次沖洗量為100ml，總沖洗量不得超過(guò)1000mL，以免濾膜上微生物受損傷。,無(wú)菌檢查法-薄膜過(guò)濾法,,,,沖洗后分別將100mL硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基加入相應(yīng)的濾筒內(nèi)，培養(yǎng)。,無(wú)菌檢查法 培養(yǎng)及觀察,,上述含培養(yǎng)基的容器按規(guī)定的溫度培養(yǎng)14天。培養(yǎng)期間應(yīng)逐日觀察并記錄是否有菌生長(zhǎng)。如在加入供試品后或在培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁，培養(yǎng)14天后，不能從外觀上判斷有無(wú)微生物生長(zhǎng)，可取該培養(yǎng)液適量轉(zhuǎn)種至同種新鮮培

41、養(yǎng)基中，細(xì)菌培養(yǎng)2天、真菌培養(yǎng)3天，觀察接種的同種新鮮培養(yǎng)基是否再出現(xiàn)渾濁；或取培養(yǎng)液涂片，染色，鏡檢，判斷是否有菌。,若供試品管均澄清，或雖顯渾濁但經(jīng)確證無(wú)菌生長(zhǎng)，判供試品符合規(guī)定；若供試品管中任何一管顯渾濁并確證有菌生長(zhǎng)，判供試品不符合規(guī)定，除非能充分證明試驗(yàn)結(jié)果無(wú)效，即生長(zhǎng)的微生物非供試品所含。 試驗(yàn)若經(jīng)確認(rèn)無(wú)效，應(yīng)重試。重試時(shí)，重新取同量供試品，依法檢查，若無(wú)菌生長(zhǎng)，判供試品符合規(guī)定；若有菌生長(zhǎng)，判供試品

42、不符合規(guī)定。,陽(yáng)性對(duì)照管應(yīng)生長(zhǎng)良好，陰性對(duì)照不得有菌生長(zhǎng)。否則，試驗(yàn)無(wú)效。,無(wú)菌檢查法 結(jié)果判斷,,當(dāng)符合下列至少一個(gè)條件時(shí)，方可判試驗(yàn)結(jié)果無(wú)效：       （1）無(wú)菌檢查試驗(yàn)所用的設(shè)備及環(huán)境的微生物監(jiān)控結(jié)果不符合無(wú)菌檢查法的要求；      （2）回顧無(wú)菌試驗(yàn)過(guò)程，發(fā)現(xiàn)有可能引起微生物污染的因素。&

43、#160;           （3）供試品管中生長(zhǎng)的微生物經(jīng)鑒定后，確證是因無(wú)菌試驗(yàn)中所使用的物品和（或）無(wú)菌操作技術(shù)不當(dāng)引起的。,無(wú)菌檢查法 結(jié)果判斷,試驗(yàn)若經(jīng)確認(rèn)無(wú)效，應(yīng)重試。重試時(shí)，重新取同量供試品，依法檢查，若無(wú)菌生長(zhǎng)，判供試品符合規(guī)定；若有菌生長(zhǎng)，判供試品不符合規(guī)定。,無(wú)菌檢查法 結(jié)果判斷,醫(yī)療器械無(wú)菌試驗(yàn)檢查

44、要點(diǎn)指南（2010版）,,,由于無(wú)菌檢驗(yàn)時(shí)間跨度較長(zhǎng)，因此過(guò)程的記錄應(yīng)能夠完整體現(xiàn)試驗(yàn)的全過(guò)程，對(duì)于在試驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)的各種情況，均應(yīng)在記錄中客觀反映。,直接接種法試驗(yàn)結(jié)果,,,薄膜過(guò)濾法試驗(yàn)結(jié)果,,,無(wú)菌檢查法 判定,,,,試驗(yàn)報(bào)告中宜給出下列信息： 供試品名稱(chēng)；生產(chǎn)批號(hào)和（或）滅菌批號(hào)；供試液制備方法；接種方式；每日觀察結(jié)果（包括陰、陽(yáng)性對(duì)照）；結(jié)果判定,試驗(yàn)報(bào)告,（1）培養(yǎng)基配制記錄（2）滅菌器、天平等儀器的使用記錄

45、（3）培養(yǎng)基無(wú)菌性檢查、靈敏度檢查記錄（4）菌種購(gòu)買(mǎi)、傳代、使用記錄（5）方法學(xué)驗(yàn)證記錄（6）無(wú)菌試驗(yàn)記錄（7）滅菌物品制作（8）廢棄物處理記錄（9）潔凈間監(jiān)測(cè)記錄,醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)應(yīng)有記錄,一、適用范圍 二、檢查內(nèi)容1.選擇的無(wú)菌檢驗(yàn)方法 2.檢驗(yàn)人員 資質(zhì)3.現(xiàn)場(chǎng)察看無(wú)菌實(shí)驗(yàn)室環(huán)境4.設(shè)備和器具 5.管理制度、操作規(guī)程等相關(guān)技術(shù)文件 6. 查閱試驗(yàn)記錄 三、其它應(yīng)注意的問(wèn)題,醫(yī)療器械無(wú)菌試驗(yàn)檢查要點(diǎn)

46、指南（2010版）,（1）培養(yǎng)基制備 （2）供試品的無(wú)菌檢查 （3）培養(yǎng)及觀察 （4）結(jié)果判斷,（1）樣品記錄 （2）滅菌物品制作記錄 （3）原始試驗(yàn)記錄 （4）廢棄物處理記錄,,,醫(yī)療器械無(wú)菌試驗(yàn)檢查要點(diǎn)指南（2010版）,,,其它應(yīng)注意的問(wèn)題還包括： 生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)確保樣品具有代表性：試驗(yàn)樣品應(yīng)從常規(guī)產(chǎn)品中能夠代表加工過(guò)程和條件的批中選擇。選擇樣品是隨機(jī)的。試驗(yàn)樣品的選擇和處理技術(shù)應(yīng)明確，以免對(duì)樣品上所含的微生物的數(shù)量

47、和種類(lèi)造成污染和改變。試驗(yàn)樣品可以選擇制造過(guò)程中的不合格產(chǎn)品，它們應(yīng)該代表這個(gè)生產(chǎn)批的加工程序和條件。用于試驗(yàn)的不合格產(chǎn)品應(yīng)不會(huì)影響無(wú)菌測(cè)試的有效性。,醫(yī)療器械無(wú)菌試驗(yàn)檢查要點(diǎn)指南（2010版）,,,其它應(yīng)注意的問(wèn)題還包括： 生產(chǎn)企業(yè)對(duì)于供試品的選取、轉(zhuǎn)移過(guò)程要采取防止污染措施，確保試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。選取制作供試品的試驗(yàn)樣品時(shí)，樣品包裝須完好無(wú)損，尤其是只有一層包裝的樣品。進(jìn)入無(wú)菌檢驗(yàn)室的樣品若有兩層（或兩層以上）包裝的，需將

48、外包裝在傳遞窗（或緩沖間）拆除后，傳入實(shí)驗(yàn)室。,無(wú)菌試驗(yàn)要點(diǎn),器具滅菌：所有器具高壓滅菌121℃30min，硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基: 接種前, 培養(yǎng)基氧化層的高度不得超過(guò)培養(yǎng)基深度的1/5，30℃ ~ 35℃培養(yǎng)14天。改良馬丁培養(yǎng)基： 23℃ ~ 28℃培養(yǎng)14天。兩種培養(yǎng)基要符合無(wú)菌性檢查及靈敏度檢查的要求；,無(wú)菌試驗(yàn)要點(diǎn),供試品包裝完好。培養(yǎng)基、供試品消毒后帶入無(wú)菌室。采用驗(yàn)證過(guò)檢查方法（直接接種法或薄膜過(guò)濾

49、法）在潔凈度10 000級(jí)下的局部100級(jí)區(qū)域內(nèi)，以無(wú)菌操作法將規(guī)定量的供試品或供試液分別接種至兩種培養(yǎng)基中，同時(shí)做陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照；按規(guī)定的溫度培養(yǎng)14天。逐日觀察并記錄。如在培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁，培養(yǎng)14天后，不能從外觀上判斷有無(wú)微生物生長(zhǎng)，可取該培養(yǎng)液適量轉(zhuǎn)種至同種新鮮培養(yǎng)基中，細(xì)菌培養(yǎng)2天、真菌培養(yǎng)3天，觀察接種的同種新鮮培養(yǎng)基是否再出現(xiàn)渾濁；或取培養(yǎng)液涂片，染色，鏡檢，判斷是否有菌。,無(wú)菌試驗(yàn)要點(diǎn),陽(yáng)性對(duì)照管應(yīng)生長(zhǎng)良好

50、，陰性對(duì)照不得有菌生長(zhǎng)。供試品管均應(yīng)澄清，或雖顯渾濁但經(jīng)確證無(wú)菌生長(zhǎng)，判供試品符合規(guī)定；若供試品管中任何一管顯渾濁并確證有菌生長(zhǎng)，判供試品不符合規(guī)定，除非能充分證明試驗(yàn)結(jié)果無(wú)效，即生長(zhǎng)的微生物非供試品所含。 出具試驗(yàn)結(jié)果后，所有培養(yǎng)物121℃高壓滅菌30分鐘處理。 做好相應(yīng)試驗(yàn)記錄。,實(shí)例：薄膜過(guò)濾法——考察沖洗量 試驗(yàn)菌： (1)生孢梭菌64941 (2)銅綠假單胞菌101

51、04 (3)枯草芽孢桿菌 63501 (4) 金黃色葡萄球菌26003總?cè)恿浚?5g / 每株試驗(yàn)菌,,,+:對(duì)照管;　 1:沒(méi)有沖洗; 2:沖洗液體積200ml; 3:沖洗液體積400ml.35℃,培養(yǎng)24小時(shí).,+:對(duì)照管;　 1:沒(méi)有沖洗; 2:沖洗液體積200ml.35℃,培養(yǎng)48小時(shí).,結(jié)論

52、:,1.紅霉素對(duì)生孢梭菌生長(zhǎng)無(wú)抑制作用.2.紅霉素對(duì)銅綠假單孢菌生長(zhǎng)無(wú)抑制作用.,＋ :對(duì)照管;　 1:沒(méi)有沖洗; 2:沖洗液體積200ml; 3:沖洗液體積400ml.35℃,培養(yǎng)72小時(shí).,1.紅霉素對(duì)枯草芽孢桿菌有抑制作用.每筒加樣量5g(相當(dāng)于紅霉素25mg)。2. 沖洗液體積400ml,枯草芽孢桿菌48小時(shí)后可見(jiàn)微弱生長(zhǎng),72小時(shí)生長(zhǎng)良好。3. 在該檢驗(yàn)條件下,沖洗400ml,三天內(nèi)可檢出枯草芽

53、孢桿菌.,結(jié)論:,,,+:對(duì)照管;　 1:沒(méi)有沖洗; 2:沖洗液體積200ml;3:沖洗液體積400ml.35℃,培養(yǎng)72小時(shí).,,500:沖洗液體積500ml; 700:沖洗液體積700ml.35℃,培養(yǎng)72小時(shí).,結(jié)論:,1.紅霉素對(duì)金黃色葡萄球菌有抑制作用。2.在該檢驗(yàn)條件下,沖洗700ml,殘留的紅霉素不影響金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)。,,,醫(yī)療器械初始污染菌檢驗(yàn)技術(shù),GB 15979-2002 一次性使用衛(wèi)

54、生用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn),初始污染菌的檢驗(yàn),初始污染菌：產(chǎn)品消毒、滅菌前的細(xì)菌總數(shù)，可判明檢品受細(xì)菌污染的程度以及生產(chǎn)單位所用的原料、工具設(shè)備、工藝流程、生產(chǎn)人員的衛(wèi)生狀況，是對(duì)檢品進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)評(píng)價(jià)的綜合依據(jù)。,GB 15979-2002 一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn) 初始污染菌：產(chǎn)品消毒、滅菌前的細(xì)菌總數(shù)，可判明檢品受細(xì)菌污染的程度以及生產(chǎn)單位所用的原料、工具設(shè)備、工藝流程、生產(chǎn)人員的衛(wèi)生狀況，是對(duì)檢品進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)評(píng)價(jià)的綜合依

55、據(jù)。 微生物限度檢查法：檢查非規(guī)定滅菌產(chǎn)品受微生物污染程度的方法。 消毒與滅菌的區(qū)別:消毒是殺滅清除傳播媒介上病原微生物。但不能殺死芽孢等全部微生物。所以消毒是不徹底的，不能代替滅菌。,初始污染菌的檢驗(yàn),,,初始污染菌的檢驗(yàn),,部分一次性使用衛(wèi)生產(chǎn)品微生物學(xué)指標(biāo)要求,注：致病性化膿菌指綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌與溶血性鏈球菌。,初始污染菌的檢驗(yàn),準(zhǔn)備：平皿洗凈、烘干；牛皮紙包好滅菌

56、 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基配制、滅菌。步驟：采樣，供試液制備，培養(yǎng)，菌落計(jì)數(shù),在100級(jí)凈化條件下用無(wú)菌方法打開(kāi)至少3個(gè)包裝； 從每個(gè)包裝中取樣，準(zhǔn)確稱(chēng)取10g±1g樣品；剪碎后加入200mL無(wú)菌生理鹽水中，充分混勻。 液體產(chǎn)品用原液直接做樣液。,初始污染菌的檢驗(yàn),,取上清液共接種5個(gè)平皿，每個(gè)平皿中加入1mL供試液,用冷卻至45℃左右的熔化的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（15 ~ 20）mL，倒入每個(gè)平皿內(nèi)混合均勻。,

57、待瓊脂凝固后翻轉(zhuǎn)平皿置35 ℃±2 ℃培養(yǎng)48h后，計(jì)算平板上的菌落數(shù)。,稀釋度 5,,細(xì)菌菌落總數(shù)=5塊平板上的細(xì)菌菌落總數(shù)×（cfu/g或cfu/mL）,如：取10g樣品入200mL生理鹽水中，則稀釋20倍,當(dāng)菌落數(shù)在100以?xún)?nèi)，按實(shí)有數(shù)報(bào)告，大于100時(shí)采用二位有效數(shù)字。,初始污染菌的檢驗(yàn),,計(jì)數(shù)方法：將平板置菌落計(jì)數(shù)器或從平板的背面直接以肉眼用標(biāo)記筆點(diǎn)計(jì)，以投射光襯以暗色背景，仔細(xì)觀察，計(jì)數(shù)。必要時(shí)

58、可以借助于放大鏡、菌落計(jì)數(shù)器。菌落特征： ⑴形態(tài)特征：常為白色、灰白色或灰色，亦有淡褐色、淡黃色。 ⑵邊緣整齊或不整齊，表面有光滑、粗糙，皺褶、突起或扁平。 ⑶大小差異很大。,初始污染菌的檢驗(yàn),,如果樣品菌落總數(shù)超過(guò)本標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定，應(yīng)將留存的復(fù)檢樣品依前法復(fù)測(cè)2次， 2次結(jié)果平均值都達(dá)到本標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定，則判定被檢樣品合格；其中有任何一次結(jié)果平均值超過(guò)本標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定，則判定被檢樣品不合格。,大腸菌群檢測(cè)方法,樣液5m

59、L接種至50mL乳糖膽鹽發(fā)酵管， 置35 ℃±2 ℃培養(yǎng)24h，如不產(chǎn)酸產(chǎn)氣，則大腸菌群為陰性。,如產(chǎn)酸產(chǎn)氣，則劃線接種伊紅美藍(lán)瓊脂平板，置35 ℃±2 ℃培養(yǎng)18~24h，觀察平板上菌落形態(tài)。,取疑似菌落作革蘭氏染色鏡檢，同時(shí)接種乳糖發(fā)酵管，置35 ℃±2 ℃培養(yǎng)24h，觀察產(chǎn)氣情況。,凡乳糖膽鹽發(fā)酵管產(chǎn)酸產(chǎn)氣，乳糖發(fā)酵管產(chǎn)酸產(chǎn)氣，在伊紅美藍(lán)平板上有典型大腸菌落，革蘭氏染色為陰性無(wú)芽孢桿菌，可報(bào)告被檢樣品

60、檢出大腸桿菌。,乳糖膽鹽培養(yǎng)基中用的是溴甲酚紫作指示劑，該指示劑中性時(shí)呈藍(lán)紫色，酸性時(shí)呈黃色，大腸桿菌能分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，因此培養(yǎng)基變成黃色和產(chǎn)生氣泡。,綠膿桿菌檢測(cè)方法,樣液5mL接種至50mL SCDLP培養(yǎng)液中，充分混勻， 置35 ℃±2 ℃培養(yǎng)(18~24)h，如有綠膿桿菌生長(zhǎng)，表面呈現(xiàn)一層薄菌膜，培養(yǎng)液常呈黃綠色或藍(lán)綠色。,從培養(yǎng)液菌膜處挑取培養(yǎng)物，劃線接種十六烷三甲基溴化銨瓊脂平板，置35 ℃±2 ℃培養(yǎng)

61、(18~24)h，觀察菌落特征。綠膿桿菌生長(zhǎng)良好，其他菌不長(zhǎng)。,取疑似菌落作革蘭氏染色鏡檢，為陰性者需進(jìn)行氧化酶、綠膿菌素、硝酸鹽還原產(chǎn)氣、明膠液化等一系列試驗(yàn)。,金黃色葡萄球菌檢測(cè)方法,樣液5mL接種至50mL SCDLP培養(yǎng)液中，充分混勻， 置35 ℃±2 ℃培養(yǎng)24h。,如有菌生長(zhǎng)，劃線接種在血瓊脂培養(yǎng)基上，置35 ℃±2 ℃培養(yǎng)(18~24)h，觀察菌落特征。,取疑似菌落作革蘭氏染色鏡檢，為陽(yáng)性呈葡萄狀，無(wú)芽

62、孢莢膜者，需進(jìn)行甘露醇發(fā)酵、血漿凝固酶等一系列試驗(yàn)。,溶血性鏈球菌檢測(cè)方法,樣液5mL接種至50mL葡萄糖肉湯中，充分混勻， 置35 ℃±2 ℃培養(yǎng)24h。,如有菌生長(zhǎng)，劃線接種在血瓊脂培養(yǎng)基上，置35 ℃±2 ℃培養(yǎng)18h~24h，觀察菌落特征。,取疑似菌落作革蘭氏染色鏡檢，如為陽(yáng)性呈鏈狀排列的球菌，需進(jìn)行鏈激酶桿菌肽敏感等一系列試驗(yàn)。,真菌菌落總數(shù)檢測(cè)方法,若標(biāo)準(zhǔn)對(duì)真菌菌落總數(shù)有具體數(shù)值要求，則測(cè)試方法基本同細(xì)菌

63、菌落總數(shù)檢測(cè)方法，只是培養(yǎng)基采用沙氏培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為25 ℃±2 ℃培養(yǎng)7天。,若標(biāo)準(zhǔn)要求真菌不得檢出，則取樣液5mL接種至50mL沙氏培養(yǎng)基中，25 ℃±2 ℃培養(yǎng)7天，逐日觀察有無(wú)真菌生長(zhǎng)；若培養(yǎng)管渾濁應(yīng)轉(zhuǎn)種沙氏瓊脂培養(yǎng)基，證實(shí)有真菌生長(zhǎng)，可報(bào)告被檢樣品檢出真菌。,微生物學(xué)檢查,無(wú)菌檢查,微生物限度檢查,其他（初始污染菌）,細(xì)菌、真菌數(shù)量,控制菌（大腸、金葡、綠膿等）,,,,,醫(yī)療器械的無(wú)菌和初始污染菌檢驗(yàn)相