造血調(diào)控

1、造血（hematopoiesis）,,造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cell)分化為早期祖細(xì)胞(primitive progenitor cell) ，經(jīng)增殖分化成為晚期祖細(xì)胞(late progenitor cell)，再分化為具有特異形態(tài)的、骨髓中不同系別前體細(xì)胞(precursor cell)，最后分化成為各類具有生理功能的血細(xì)胞的整個過程稱為“造血” 。,造血不包括成熟血細(xì)胞在體內(nèi)儲存、釋放、分配和凋亡的過程

2、。,第一節(jié) 造血器官,人體的造血器官是生成血液的器官。起源于中胚葉，主要包括骨髓、胸腺、淋巴結(jié)、 肝臟和脾等。造血過程分為胚胎期造血和出生后造血。,一、胚胎期造血器官,人類的血液細(xì)胞首先在卵黃囊中形成，肝、脾、胸腺和骨髓均參與造血根據(jù)發(fā)育過程中造血中心的轉(zhuǎn)移，胚胎期造血分為三個時期： 卵黃囊造血期 、肝造血期 、骨髓造血期,胚胎期造血的三個時期不能截然分開，此消彼長，互為交錯。,二、出生后造血,出生后造血主要靠骨髓。

3、在正常情況下骨髓是唯一能產(chǎn)生紅細(xì)胞、粒細(xì)胞和血小板的場所，也生成淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。脾和淋巴結(jié)為終生制造淋巴細(xì)胞的器官。,一、造血細(xì)胞的生長發(fā)育 是一個連續(xù)不斷的復(fù)雜過程，造血器官內(nèi)的各種造血細(xì)胞在造血微環(huán)境中通過細(xì)胞與細(xì)胞之間相互作用，在各種細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下，按一定的規(guī)律發(fā)育成為各種成熟的血細(xì)胞，然后釋放入血循環(huán)中。,第二節(jié) 造血干/祖細(xì)胞的生長發(fā)育特性,（一）基本過程,造血細(xì)胞的生長發(fā)育包括增殖、分化

4、、成熟和釋放四個方面。,造血細(xì)胞的增殖（proliferation）,是指血細(xì)胞通過分裂而使其數(shù)量增加的過程。有絲分裂是造血細(xì)胞的主要增殖方式。,造血細(xì)胞的分化（differentiation）細(xì)胞發(fā)育過程中失去某些潛能而獲得新功能的過程，即由多潛能轉(zhuǎn)變?yōu)閱螡撃艿倪^程。分裂后的細(xì)胞在形態(tài)和功能上產(chǎn)生新的特征，分化過程是不可逆的。,造血細(xì)胞的成熟（maturation）造血干細(xì)胞定向分化，從原始經(jīng)幼稚到成熟細(xì)胞的發(fā)育過程。血細(xì)胞越成

5、熟其形態(tài)越易辨認(rèn)，功能也日趨完善。成熟的血細(xì)胞在骨髓內(nèi)通過“髓血屏障”釋放入血循環(huán)中。,（二）造血細(xì)胞生長發(fā)育階段,根據(jù)造血細(xì)胞的功能和形態(tài)特征，造血細(xì)胞生長發(fā)育階段可分為： 造血干細(xì)胞 造血祖細(xì)胞 原始及幼稚細(xì)胞,,,,,,造血干細(xì)胞階段,造血祖細(xì)胞階

6、段,原始及幼稚細(xì)胞階段,成熟細(xì)胞,二、造血干細(xì)胞特性,干細(xì)胞（stem cell）是具有自我復(fù)制和多向分化能力的細(xì)胞。,早期胚胎中的原始生殖細(xì)胞即胚胎干細(xì)胞，具有廣泛的發(fā)育和分化潛能，稱為全能干細(xì)胞（totipotent hematopoietic stem cell，THSC）。,造血干細(xì)胞又稱多能干細(xì)胞，由中胚層細(xì)胞分化而來，是各種血細(xì)胞的始祖，具有高度自我更新、多向分化和增殖能力，并且在造血組織中含量極少，其形態(tài)酷似小淋巴樣細(xì)胞而

7、難以辨認(rèn)。,1.造血干細(xì)胞的基本特征 （1）自我更新（self-renewal）與自我維持（self-maintenance） 干細(xì)胞在不斷產(chǎn)生祖細(xì)胞的同時又保持自己數(shù)量和自身特性不變。 高度的自我更新能力是造血干細(xì)胞最基本的生物學(xué)特征之一。,（2） 造血干細(xì)胞靜止?fàn)顟B(tài),干細(xì)胞95%以上細(xì)胞處于G0期靜止?fàn)顟B(tài)，不進(jìn)行DNA合成和有絲分裂，當(dāng)機(jī)體發(fā)生缺氧、感染、失血和創(chuàng)傷等應(yīng)激狀態(tài)時

8、，干細(xì)胞從靜止進(jìn)入增殖的數(shù)量增加，以滿足機(jī)體對造血的需求。,（3） 造血干細(xì)胞全能性（多向分化）,分化是不可逆的，一旦定向分化為某種祖細(xì)胞，就不可能再變成其它的祖細(xì)胞。,造血干細(xì)胞在特定的條件下可以分化成紅細(xì)胞、粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、血小板、組織嗜堿細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞等的祖細(xì)胞。,（4） 造血干細(xì)胞不均一性（heterogeneity）,造血干細(xì)胞有增殖態(tài)與靜止態(tài)之分，并且不斷地在靜止和增殖態(tài)之間轉(zhuǎn)換。造血干細(xì)胞代齡

9、（有絲分裂的次數(shù)）不同構(gòu)成了干細(xì)胞群體的代齡結(jié)構(gòu)，形成干細(xì)胞不均一性。,2．造血干細(xì)胞檢測 單個細(xì)胞在生物體內(nèi)有能力長期重建造血是判斷該細(xì)胞為造血干細(xì)胞的“金標(biāo)準(zhǔn)”。造血干細(xì)胞的數(shù)量極少，形態(tài)上不能區(qū)別，干細(xì)胞抗原性弱，僅有很少表面抗原。,（1）脾集落測試法 1961年Till等首先采用體內(nèi)試驗(yàn)小鼠脾集落形成間接證明了造血干細(xì)胞的存在：將受體小鼠以致死劑量射線照射后，破壞全部造血細(xì)胞，再輸以供體骨髓或血液，小鼠能存活，并在

10、受體小鼠脾中形成紅系、粒系、巨核系細(xì)胞結(jié)節(jié)，這些都是由單個細(xì)胞增殖分化而來，即脾集落形成單位（CFU-S）。,（2）單克隆抗體法,CD34+ CD38—單個細(xì)胞可形成原代集落，并可向紅系、粒系、巨噬系、巨核系等 細(xì)胞分化。,CD34+CD38—細(xì)胞的性能接近于造血干細(xì)胞，同時也證明了造血干細(xì)胞具有多向分化的能力。,利用FACS自動細(xì)胞分選系統(tǒng)分選出CD34+CD38+及CD34+CD38—亞群細(xì)胞。,CD34+ 細(xì)胞具有長期重建造血的能

11、力。,CD34+ CD38—細(xì)胞比CD34+ 細(xì)胞具有更強(qiáng)的長期造血能力。,（三）造血干／祖細(xì)胞的臨床應(yīng)用,造血干／祖細(xì)胞移植主要應(yīng)用于：1.血液系統(tǒng)惡性腫瘤，如急、慢性白血病等；2.血液系統(tǒng)非惡性腫瘤性疾病，如再生障礙性貧血、異常血紅蛋白病、Fanconi貧血、難治性貧血等；3.實(shí)體腫瘤化療后造血重建，如乳腺癌、卵巢癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤等；4.其他，如重癥聯(lián)合免疫缺陷癥、自身免疫性疾病、基因治療等。,第三節(jié) 造血調(diào)控,造血細(xì)胞的

12、增殖、分化受控于不同的調(diào)控系統(tǒng)。 其中細(xì)胞因子的調(diào)控占重要地位。,細(xì)胞因子（cytokines）是一組基因編碼的低分子量蛋白質(zhì)細(xì)胞外信號分子，有的是糖蛋白，有的則不含糖基，在機(jī)體內(nèi)含量極低，半衰期短，主要功能是在細(xì)胞間傳遞信息，從而影響造血活動。,一、集落刺激因子類( colony-stimulating factors, CSFs ),2.粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF) 除促進(jìn)粒系祖細(xì)胞形成集落外，還可誘導(dǎo)某些白血

13、病細(xì)胞株分化成熟。,3.粒－巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF) 促進(jìn)中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞祖細(xì)胞增殖、分化 成熟，對成熟細(xì)胞也產(chǎn)生作用。,1.紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO） 刺激紅系祖細(xì)胞的增殖和分化。,4.巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF） 促進(jìn)單核系祖細(xì)胞的增殖和分化，激活巨噬細(xì)胞的吞噬和分泌功能。,5.多系集落刺激因子（multi-CSF） 促進(jìn)多系集落生長。,6.血小板生成素

14、（thrombopoietin, TPO） 促進(jìn)巨核細(xì)胞集落形成。,二、白細(xì)胞介素（interleukin, IL),白細(xì)胞介素主要是白細(xì)胞產(chǎn)生的信號分子，不僅在免疫系統(tǒng)中傳遞信息，同時也參與造血系統(tǒng)的造血調(diào)控。,三、其它細(xì)胞因子,1.干細(xì)胞因子（stem cell factor, SCF）/肥大細(xì)胞生長因子 促進(jìn)肥大細(xì)胞生長；協(xié)同促進(jìn)造血干／祖細(xì)胞增殖、分化。2.FLT-3配基(FLT-3 ligand, FL)

15、 誘導(dǎo)處于靜止期的造血干／祖細(xì)胞進(jìn)人細(xì)胞周期，促進(jìn)其擴(kuò)增。,1．原癌基因 如：c-myc基因、ras相關(guān)基因、c-abl基因、bcl-2 基因、c-kit基因等。,四、造血基因調(diào)控,原癌基因的編碼產(chǎn)物可為：細(xì)胞因子、細(xì)胞因子受體、細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶、細(xì)胞內(nèi)信號傳遞分子及轉(zhuǎn)錄因子等。,2. 抑癌基因,如：p53基因、WT1基因、NF1基因、DCC、Rb基因等。抑癌基因編碼產(chǎn)物通常為細(xì)胞增殖負(fù)調(diào)節(jié)因子，抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)終末分化、

16、維持基因穩(wěn)定、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等。,3. 轉(zhuǎn)錄因子參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控,對造血中基本的基因調(diào)控機(jī)制 仍存在若干懸念有待研究：,（1）如何在細(xì)胞周期G1與G0之間來回轉(zhuǎn)換，并保持絕大多數(shù)細(xì)胞處于G0靜止?fàn)顟B(tài)? （2）干細(xì)胞不對稱有絲分裂在基因水平上是怎樣實(shí)現(xiàn)的?（3）干/祖細(xì)胞基因怎樣調(diào)控各類受體表達(dá)，以接受造血微環(huán)境中各種信號的影響?（4）干細(xì)胞在基因水平如何調(diào)控決定分化方向?怎樣保持各系之間正常恒定比例?,第四節(jié) 造血干

17、／祖細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù),體內(nèi)造血干／祖細(xì)胞在一個極復(fù)雜的造血微環(huán)境中增殖、分化生成血液細(xì)胞。體外造血祖細(xì)胞培養(yǎng)就是在體外模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，將從機(jī)體中分離出的造血祖細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，使之生存、增殖分化。,一、造血干／祖細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本條件,（一）細(xì)胞培養(yǎng)室條件（二）培養(yǎng)的支持物（三）營養(yǎng)液（四）細(xì)胞因子（五）血清,二、造血干／祖細(xì)胞體外培養(yǎng)方法,（一）造血祖細(xì)胞集落培養(yǎng)：（1）分離培養(yǎng)細(xì)胞，制成單個核細(xì)胞懸液。（2）配制培養(yǎng)體

18、系：按比例將培養(yǎng)液、細(xì)胞、血清、細(xì) 胞因子加入到培養(yǎng)體系，混勻。（3）將配制的培養(yǎng)體系在37℃水浴中保溫10min。（4）將瓊脂等支持物煮沸融化（甲基纖維素不需加熱）。,（5）待支持物降至40℃左右，加入培養(yǎng)體系并混勻。（6）將混勻后的培養(yǎng)體系加入培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板孔內(nèi)， 一般平行做3份。（7）于5% CO2、飽和濕度及37℃溫箱內(nèi)孵育。BFU-E 需14天，CF

19、U-E需7天。（8）觀察結(jié)果。,紅細(xì)胞爆式集落形成單位 （BFU-E）,,紅細(xì)胞的祖細(xì)胞體外培養(yǎng),紅細(xì)胞集落形成單位 (CFU-E),（二）紅系祖細(xì)胞誘導(dǎo)分化的液體培養(yǎng)：,MediumFBSEPOStem cell factorIL3,三、造血祖細(xì)胞培養(yǎng)的主要應(yīng)用：,1）檢測造血祖細(xì)胞在骨髓、外周血和臍血中的數(shù)量；2）研究體外造血祖細(xì)胞類型、特性及生理意義；3）利用人工培養(yǎng)條件易