男性學(xué)實驗室檢查與質(zhì)控

1、王振強zhen-qiang wang,男性學(xué)實驗室檢查與質(zhì)控,,山西省兒童醫(yī)院 婦幼保健院 生殖中心 男性學(xué)實驗室,不育癥的發(fā)生率為10％－15％，其中約30％由于男性因素引起的，統(tǒng)稱為男性不育癥。男性不育癥患者大部分沒有明顯的臨床癥狀。實驗室檢測是評價男性生殖能力的重要手段。,量 2.0ml或更多PH 7.2或更多精子

2、密度 20×106／ml或更多總精子數(shù) 40×106/一次射精或更多活力 射精后60分鐘內(nèi)，50％或更多具有前向運動 （即a+b級），或25％或更多具有快速前向運動（a級）畸形率 ＜ 85％存活率 50％或更多存活白細胞 ＜1×106／ml 該指標參考《WHO人類精液及精子宮頸粘液相互作用實驗室檢驗手冊（第四

3、版）,精液分析正常參考值：,正常精子狀態(tài) 射出的精液符合參考值少精子癥 精子濃度低于參考值 (精子密度<20×106／ml或總精子數(shù)<40×106/一次射精)弱精子癥 精子活力低于參考值(a+b級<50％或a級<25％)畸精子癥 具有正常形態(tài)的精子少于參考值(正常形態(tài)<15%)少、弱、畸精子癥 表

4、示3種變量均異常（兩種變量異常時，可用兩個前綴）無精子癥 所射精液中無精子無精液癥 不射精,精液變量的術(shù)語：,,精子—宮頸粘液相互作用檢測體內(nèi)試驗（性交后試驗）PCT1. 時間選擇 在排卵期進行。2. >2天避免性生活,性交后9—12小時進行試驗.3. 在陰道后穹窿部吸取混合樣本及用另一個注射器或?qū)Ч芪m頸管內(nèi)的粘液標本。將這些標本置于載玻片上，加蓋玻片，顯微鏡觀察

5、結(jié)果觀察 性交后9—12小時進行精子活力分級:a，快速直線前向運動；b，慢或緩慢的前向運動； C，非前向運動；d，不活動精子。意義:能夠提供精子壽命和存活情況.前向運動的精子可排除宮頸因素作為不育原因的可能性。,,簡化的玻片試驗將一滴宮頸粘液置于載玻片上，用蓋玻片鋪平。載玻片兩側(cè)各滴1滴精液，使其與蓋玻片邊緣接觸，借助于毛細作用使精液移向蓋玻片下，在宮頸粘液與精液之間形成一個清晰的接觸界面。

6、該載玻片置于濕潤的溫箱內(nèi)，37孵育30分鐘結(jié)果報告正常精子穿透粘液90%以上具有直線運動的精子精子穿透粘液相的距離<500um（約10個精子的長度）異常精子穿透粘液相，但很快失活或僅作“抖動”表示抗精子抗體的存在精子未穿透精液—粘液的接觸界面。,,男性學(xué)組合項目精液分析操作常規(guī)(參照《WHO人類精液及精子-宮頸粘液相互作用實驗室檢驗手冊》第四版)精液標本采集時間應(yīng)在禁欲后2-7天。囑病人按《取精指南》在實驗室

7、設(shè)立的取精室內(nèi)采集精液。記錄病人及其妻子姓名、聯(lián)系電話、禁欲時間、標本采集時間及標本分析時間、采集是否完全。記錄精液總量、PH、液化時間、液化狀態(tài)、外觀、粘稠度。顯微鏡初檢：用高倍鏡（40×）觀察10個視野，初步估計精子密度、活力、精子凝集和非精子細胞。估記精子密度>40×106/ml時，用F-10培養(yǎng)液按比例稀釋精液，以避免精子碰撞造成分析錯誤。取一滴精液置Hamilton CASA系統(tǒng)進行分析。系

8、統(tǒng)設(shè)置：CASA系統(tǒng)溫度設(shè)置為37℃，根據(jù)精子密度選擇Analysis setup: Standard、High density、user-1（低密度精子分析）。應(yīng)選擇精子分布均勻的視野掃描，如精子密度>20×106/ml時，應(yīng)分析超過400條精子。顯微鏡檢查未見精子的標本應(yīng)用3000g離心15分鐘，把所有沉渣重新懸浮成0.2ml，再徹底檢查后發(fā)現(xiàn)無精子，才能作出無精子的判斷。如離心后發(fā)現(xiàn)有精子可按下列公式計算精子

9、密度。離心后體積×精子密度 精液總量 精子密度（×106/ml） 8． 精子存活率計數(shù)將新鮮精液與伊紅染液1：1在試管中混勻，30秒后取一滴上述液體置載玻片上并覆以蓋玻片在400倍光學(xué)顯微鏡下觀察。活精子不著色，死精子被染成紅色，觀察200個精子計數(shù)存活率。,,男性學(xué)組合項目計算機輔助精子分析（CASA）V

10、CL-曲線速度（μm/s）精子頭沿其實際的曲線。VSL-直線速度（μm/s）根據(jù)精子頭在開始檢測時的位置與最后所處位置之間的直線運動的時間平均速度。VAP-平均路徑速度（μm/s）精子頭沿其空間平均軌跡移動的時間平均速度。ALH－精子頭側(cè)擺幅度（μm/s）精子頭沿其空間平均軌跡側(cè)擺的幅度。LIH-直線性。曲線軌跡的直線性。VSL/VCL.WOB-擺動性。精子頭沿其實際軌跡的空間平均路徑擺動的尺度。VAP/VCL.STR-前向

11、性?？臻g平均路徑的直線性。VSL/VAP.BCF-鞭打頻率（鞭打次數(shù)、秒）。精子曲線軌跡越過其平均路徑軌跡的時間平均速度。MAD-平均移動角度（度）精子頭沿其曲線軌跡瞬間轉(zhuǎn)折角度的時間平均絕對值。,,男性學(xué)組合項目9． 精子形態(tài)評估：涂片取一小滴精液（5 ~ 20 ul）于載玻片上，以另一推片把精液推成薄片，干燥。如果精子密度超過20×106 / ml, 取5μl，精子密度 <20μl ,應(yīng)取10～20μl精液

12、。染色方法采用改良巴氏染色。實驗方法見附2。精子形態(tài)分類在100×油鏡下及10×目鏡分析200條帶尾部的可辨認精子的形態(tài)。計數(shù)百分率。報告四種類型缺陷：頭部畸型、頸部和中段畸型、尾部畸型、混合畸型。按照第四版精子形態(tài)分類標準，將所有形態(tài)學(xué)處于臨界狀態(tài)的精子均列為異常。在形態(tài)分類的同時如果見到許多尖頭，需要單獨記錄。精子形態(tài)分析時，同時計數(shù)非精子細胞成份，包括未成熟精細胞和白細胞等。按下列公式計數(shù)精液中的非

13、精子細胞密度。C = N×S 100N= 計數(shù)100個精子相同視野中一種特定細胞類型的數(shù)目。S= 精子細胞密度（106 / ml）。 C= 特定細胞類型密度（106 / ml）。,,多重精子缺陷指數(shù)分析 臨床意義：形態(tài)異常的精子經(jīng)常有多種缺陷。在較早的方案中，當多種缺陷同時存在時，只記錄其中一種，即頭部的缺陷先于中段的缺陷，中段的缺陷先于尾部的缺陷?，F(xiàn)在用一

14、種叫做畸形精子指數(shù)的方法（teratozoospermia index,TZI）或多種異常指數(shù)（multiple anomalies index,MAI），即用缺陷總數(shù)除以畸形精子數(shù)目，以及用精子畸形指數(shù)（sperm deformity index,SDI），即缺陷總數(shù)除以精子總數(shù)。這些參數(shù)預(yù)示精子在體內(nèi)和體外的功能情況。畸形精子指數(shù)的數(shù)值介于1.00（每個異常精子只有一種缺陷）和3.00（每個異常精子都有頭、中段及尾部缺陷）之間。報道

15、提示，畸形精子指數(shù)（TZI）>1.6與未治療不育夫婦的低生育率有關(guān)，精子畸形指數(shù)SDI >1.6提示體外受精失敗的閾值。,精子頂體酶測定 頂體酶存在于精子頂體內(nèi)膜及赤道部膜上， 是受精過程中重要的蛋白水解酶. 當精子頭部進入卵透明帶，頂體酶原被活化為頂體酶水解卵透明帶，使精子穿過卵透明帶最終與卵子融合。 頂體酶活性反映精子質(zhì)量，頂體酶活力不足可能導(dǎo)致不育。臨床精子成活率低、死精子癥以及嚴重

16、生殖系統(tǒng)感染，特別是溶脲支原體嚴重感染時可造成精子頂體酶活性降低。 頂體酶活性是判斷男性精子功能和生育力強弱的重要評價指標。,男性學(xué)組合項目,男性學(xué)組合項目,免疫性不育檢測指標:精子膜表面抗體混合凝集反應(yīng)（MAR） 檢測的是不需要任何處理的精子和免疫珠試驗（IBT）檢測的是經(jīng)洗滌后的精子 陽性 >10%活動精子包裹在致敏微球上 MAR是WHO推薦的

17、免疫性不育診斷方法 作為精子膜表面抗體常規(guī)篩選方法,前列腺分泌功能指標精漿鋅：與精子活力、抗氧化及前列腺分泌功能有關(guān)精漿檸檬酸：與前列腺分泌功能，精液液化有關(guān)精漿酸性磷酸酶:與前列腺炎有關(guān)精子頂體酶活性定量檢測判斷男性精子功能和生育力強弱的重要評價指標，頂體酶活性降低精子將難以穿透卵細胞從而導(dǎo)致不育。核蛋白組型轉(zhuǎn)換蛋白組型轉(zhuǎn)換缺陷或異?？梢鹉行圆挥蚺咛ピ缙谪舱哿鳟a(chǎn)。,男性學(xué)組合項目二,精子體外處理方法：

18、洗滌法 上游法密度梯度離心法,洗滌法 目的：增加活動精子密度和洗去精漿中影響精子活力的物質(zhì)，如白細胞、細菌、抗精子抗體等。方法：選用Ham’s F10、HTF、Earle’s等上述任何一種培養(yǎng)液，加10％血清及抗生素。液化精液移于15ml錐形離心管內(nèi)，加3倍劑量的培養(yǎng)液。離心500g×8’，棄上清夜，同法重復(fù)洗滌一次。留沉淀加入0.5ml培養(yǎng)液，制成精子懸液，密度調(diào)整為>40×106/

19、ml,上游法目的： 利用活動精子具有主動游過液體界面進入不同培養(yǎng)液的能力，而達到自行與死精，凝集精子，畸形精子和細胞雜質(zhì)分離。 適用于正常精液\液化不良精液。方法：液化精液1：3加入培養(yǎng)液，離心200g×8’，洗滌2次。留沉淀加入0.5ml培養(yǎng)液，制成精子懸液。取另一支試管加入1ml培養(yǎng)液，將0.5ml精子懸液慢慢加入試管底部，形成上下二個兩面。5％CO2、37℃孵箱內(nèi)靜置1h。

20、收集上游精子，備用,密度梯度離心法目的：利用不同成熟階段的精子和各種細胞成分各自的密度，差異使之在不同濃度的溶液中，在離心力作用下停留在不同密度面的界面上，達到較好的分離。適用于精液粘稠、嚴重少精 弱精癥。 *標準二層Puresperm法(80%、40%) 方法在錐形離心管底依次加入1.5－2ml 80％、40％ Puresperm液。將2ml精液加到40％ Puresperm液界面上，離心300g

21、5;20”棄上層液體、留沉淀物、加5ml Puresperm wash、離心500g×10’同法洗滌2次留沉淀物，加0.5ml SpermAssist制成精子懸液備用。,精液分析在男性生殖力的評估中 起著極為重要的作用,但是不同實驗室 測同一份樣本的結(jié)果常有較大差異這說明男性學(xué)實驗室各項指標 的質(zhì)控是結(jié)果可信度的保證,男性學(xué)實驗室質(zhì)量控制規(guī)則隨時――樣本結(jié)果的監(jiān)測和對比；每周――分析不同技術(shù)員

22、所做的主要精液 指標的重復(fù)測量值；每月――分析檢測結(jié)果的月均值；每季――校正加樣器；每年――校正計數(shù)板和其他設(shè)備。,質(zhì)控圖的基本控制原則 控制原則 誤差敏感一個結(jié)果超出處置限 隨機誤差或系統(tǒng)誤差連續(xù)兩個結(jié)果都超出警戒上限 系統(tǒng)誤差或

23、低于警戒下限連續(xù)兩個結(jié)果,一個高于警戒上限, 隨機誤差一個低于警戒下限連續(xù)八個結(jié)果全部高于或低于均值 系統(tǒng)性誤差,,,,,精子體外存活試驗 液化精液1：3加入培養(yǎng)液500×10’ 離心去上清液，重復(fù)洗滌一次。 留沉淀物制成1ml精子懸液，再加入2ml培養(yǎng)液使其形成上下二層界面，37℃、5％CO2孵箱中靜置1小時。 吸取上清夜，調(diào)節(jié)上游精子密度105—106/ml，活率>95％。

24、37℃、5％CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)3天，活率>70%。,培養(yǎng)液、一次性耗材質(zhì)量檢測,小鼠2-細胞胚胎發(fā)育實驗常規(guī)促排卵方法處理雌性KM小鼠，注射HCG后雌雄1:1合籠，第二天陰栓陽性的雌鼠留用。實驗前一天，分組準備培養(yǎng)液，并設(shè)對照組。標記后置37℃, 5%CO2培養(yǎng)箱平衡過夜。注射hCG 42h左右，頸椎脫臼法處死已見栓雌鼠，無菌條件下獲取2-細胞胚胎，隨機分組，每組至少有胚胎20個。37℃, 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)72