抗腫瘤藥物的篩選方法

1、抗腫瘤藥物篩選,張冬梅,一、導(dǎo)論二、整體動物水平的篩選三、細胞水平的篩選四、酶水平的篩選五、展望,一、導(dǎo)論,1. 腫瘤發(fā)病率和死亡率,全球每年癌癥新發(fā)病例都在1200萬以上，因癌癥死亡人數(shù)達760多萬，到2010年底全球腫瘤病人總數(shù)已逾5500萬人 (WHO)。,,心臟病,腦血管病,腫瘤25%,消化系統(tǒng)病,肺病,其他,中國每年新增腫瘤病人200萬人，死亡130-170多萬人左右，目前全國腫瘤患者總數(shù)約450萬人，并以每年3%的

2、速度遞增。腫瘤已經(jīng)成為中國公民的頭號殺手，每年因惡性腫瘤而死亡的人口占到總死亡率的22%。,,2009年中國居民主要疾病死亡率及死亡原因構(gòu)成,(中國衛(wèi)生年鑒),２００9年中國常見惡性腫瘤的死亡率,,,我國居民常見癌癥死亡率: 胃癌列腫瘤死亡率首位; 其次肝癌、肺癌、食管癌、結(jié)直腸癌等。,2. 腫瘤的治療方法,外科手術(shù)治療放射線治療化學(xué)藥物治療,3. 常用的化療藥物,烷化劑 環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰

3、胺抗代謝藥物 甲氨蝶呤、氟脲嘧啶、阿糖胞苷抗腫瘤抗生素 柔紅霉素、阿霉素、絲裂霉素、多柔比星鉑類化合物 順鉑、卡鉑、奧沙利鉑抗腫瘤植物藥 長春新堿、依托泊苷、替尼泊苷、紫杉醇激素類 血管新生抑制劑 貝伐珠單抗注射液、舒尼替尼、索拉非尼,化療藥物的主要不良反應(yīng),骨髓抑制（血細胞減少）胃腸

4、道反應(yīng)（惡心、嘔吐、食欲不振等）全身反應(yīng)（脫發(fā)、發(fā)熱、皮疹）對各器官影響 （心臟毒性、肝臟毒性、神經(jīng)毒性）泌尿道毒性（血尿、蛋白尿、尿酸性腎?。┚植快o脈炎致畸、致突變、致癌,4. 天然產(chǎn)物與抗腫瘤藥物,天然產(chǎn)物在新藥及新藥先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)中起著不可替代的作用，是結(jié)構(gòu)新穎和作用獨特的抗腫瘤化合物的重要來源。美國國立癌癥研究所（NCI）從1955年開始從天然產(chǎn)物中篩選抗腫瘤藥物。目前世界上被批準廣泛使用的抗腫瘤藥物中,５０

5、％以上來源于天然產(chǎn)物。,二、整體動物水平的篩選,１．非實體瘤動物模型,,常用小鼠腹水瘤動物模型表（細胞株及動物）國內(nèi)外推薦模型,腫瘤移植方法：,1）無菌操作 2）接種部位：腹腔 3）癌細胞懸液的制備及接種 接種7~10天小鼠處死，酒精消毒，穿過腹 部肌肉吸取腹水2~4 mL*，置冰塊上保存。細胞計數(shù)后，PBS稀釋制備1x107/0.1 mL細胞濃度懸液，每只小鼠注射0.2 mL 腫瘤細胞懸液注

6、射到腹腔。5天左右，小鼠出現(xiàn)腹水即為造模成功?！?*腹水應(yīng)為白色濃稠液體，若為黃色或紅色應(yīng)棄去,給藥及藥效評價：,動物分組：隨機分五組（溶劑對照組、陽性藥組、高、中、低 給藥組）；每組8-10只。藥品制備：藥品溶解生理鹽水或PBS等緩沖鹽溶液給藥方式：連續(xù)給藥；1-2次/天;（ig,ip,iv）14天以上評價指標：觀察記錄荷瘤小鼠的存活天數(shù)（30天）

7、 （7天死亡率≥20%或20%動物存活超過4周，實驗失敗 對照組存活時間14-20天）數(shù)據(jù)處理：生命延長率(%)＝ 治療組存活天數(shù)－對照組存活天數(shù) 對照組存活天數(shù) 非腹腔給藥生命延長率>50% 腹腔給藥>75%,,,,x100%,２. 實體瘤

8、動物模型,1）動物移植性腫瘤,常用小鼠、大鼠實體瘤動物模型表（細胞株及動物）,國內(nèi)外推薦模型,腫瘤移植方法：,1）無菌操作 2）接種部位：右前肢腋下 3）癌塊的制備及接種 接種7~10天小鼠處死，酒精消毒，切開皮膚取出腫瘤塊，置于生理鹽水中，冰塊上保存。剪碎瘤塊成2-3 mm3的小塊或組織塊勻漿成細胞懸液，接種到右前肢腋下。5天左右，小鼠出現(xiàn)瘤塊即為造模成功。,7天后對照組20%小鼠腫瘤小于400 mg

9、或大于2g，實驗失敗,給藥及藥效評價：,給藥方式：連續(xù)給藥；1-2次/天;（ig,ip,iv）10-12天評價指標：記錄小鼠的體重變化。12天后，處死小 鼠，撥瘤稱重（對照組瘤重1 g左右）。 取脾臟和胸腺稱重，并測定脾細胞數(shù)目數(shù)據(jù)處理：抑瘤率(%)＝ 對照組瘤

10、重－治療組瘤重 對照組瘤重 抑瘤率>30% 認為有效,,,,x100%,２）人癌異種移植模型,細胞：人源肝癌，胃癌，肺癌，結(jié)腸癌等腫瘤細胞　動物： 裸鼠 （nude mice）　　 特點： 1）裸體，行似無毛；

11、 2）不能執(zhí)行正常T細胞功能，免疫力低下 3）B細胞功能正常，NK細胞活性高,T淋巴功能缺陷先天性無胸腺小鼠 11號染色體上隱性 突變裸基因（nu）,,腫瘤移植和給藥方法：,1）無菌操作 2）接種部位：背部 3）細胞懸液的制備及接種 細胞懸液濃度1x108/mL，接種0.1mL到背部。7天左右，瘤塊達到50 mm3體積即為造

12、模成功，開始給藥。 4）給藥時間：根據(jù)藥效確定，一般12-60天。,陽性藥,5-Fu （5-氟尿嘧啶） ADM （阿霉素） Taxol（紫杉醇） CTX（環(huán)磷酰胺） 選擇性對照藥推薦劑量：1-20 mg/kg給藥方式：與測試藥物相同;常隔天給藥,藥效評價：,評價指標：記錄小鼠的體重變化。結(jié)束治療后，處 死小鼠，撥瘤稱重（對照組瘤重

13、1 g左 右）。取脾臟稱重，并測定脾細 胞數(shù)目。數(shù)據(jù)處理：抑瘤率(%)＝對照組腫瘤體積－治療組腫瘤體積 對照組腫瘤體積 抑瘤率>30% 認為有效,,,,x100%

14、,抗腫瘤譜,Taxol （卵巢癌、乳腺癌、非小細胞肺癌、頭頸癌、食管癌、淋巴瘤） 5-Fu （乳腺癌、結(jié)腸癌、直腸癌、胃癌、肝癌、宮頸癌、膀胱癌、前列腺癌和頭頸部腫瘤） ADM （ 乳腺癌、胰腺癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤和皮膚癌）,沙蟾毒精的體內(nèi)抗腫瘤作用 (Carcinogenesis, 2013, 34:1331),三、細胞水平的篩選,1. 抑制腫瘤細胞增殖實驗2. 誘導(dǎo)腫瘤細胞分

15、化實驗3. 誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡實驗4. 抗腫瘤血管生成實驗5. 腫瘤多藥耐藥性逆轉(zhuǎn)實驗6. 抗腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移實驗7. 誘導(dǎo)腫瘤細胞自噬實驗,細胞株的選擇,１. 抑制腫瘤細胞增殖實驗,A) 噻唑蘭實驗（MTT） 原理： 活細胞線粒體中脫氫酶能夠代謝還原黃色的MTT，生成藍紫色不溶于水的甲臜（Formazan）。甲臜的多少可以用酶標儀在570 nm 處進行測定。甲臜生成量與活細胞數(shù)成正比，因此可根據(jù)光密度

16、OD值推測出活細胞的數(shù)目。,MTT 原理示意圖,甲臜生成量正比于活細胞數(shù)采用比色法（570 nm）測定甲臜生成量,實驗方法,1）細胞培養(yǎng) 培養(yǎng)液：RPMI 1640、DMEM、MEM、 M199、McCoy’s5A等 血清： FBS、NBS、 抗生素：青霉素、鏈霉素、慶大霉素、 新生霉素等 胰酶： T

17、rypsin-EDTA 、Collagenase 緩沖液： PBS、HBSS等 生長因子：EGF、B-27、N-2等,2）細胞傳代 貼壁細胞生長3-5天，80%融合度。用胰酶消化1-3 min后，離心，調(diào)節(jié)適當密度重新懸浮在培養(yǎng)液中。 3）細胞計數(shù) 細胞計數(shù)板,5）細胞接種 3000-10000細胞接種在96孔板，貼壁 24小時，或?qū)?shù)生長期 6）加藥

18、處理72 h（指定時間點） 7）MTT溶液（5 mg/ml） ，孵育2-4小時 8）棄去培養(yǎng)液，加入DMSO溶解生成的 甲臜 9）酶標儀測定OD值,結(jié)果處理：,,腫瘤細胞生長抑制率（%）,=,（ OD對照-OD實驗）,,OD對照,X 100%,根據(jù)生長抑制的量效曲線求出IC50 值,腫瘤細胞存活率（%）=,OD實驗,,OD對照,X 100%,A,B,問題：根據(jù)上圖中細胞生長抑制曲線，

19、 判斷化合物A和B哪一個具有較好的 腫瘤生長抑制作用？,,Ｂ）磺酰羅丹明B （SRB）實驗,原理： SRB是粉紅色的氨基甲氧雜蒽類化合物，是蛋白結(jié)合染料，與蛋白質(zhì)的堿性氨基酸結(jié)合后呈粉紅色，用酶標儀測定其吸光度。 細胞中的蛋白含量與吸光度成正比，因此可根據(jù)光密度OD值推測出活細胞的數(shù)目和活性。,方法： 類似于ＭＴＴ法，10-20%三氯乙酸固定1 h

20、 后，加入0.5-1%ＳＲＢ染色30 min，洗去 染料，空氣干燥后，加入10 mM Tris 溶解 后，5４0 nm測定光密度結(jié)果處理：同ＭＴＴ法,Ｃ）細胞排染法（酞酚藍）,原理： 細胞損傷或死亡后細胞膜完整性被破壞，正 常細胞排染，而死亡細胞染成藍色。,伊紅、苯胺黑等染料,細胞死亡率（

21、%）,對照組活細胞數(shù)－給藥組活細胞數(shù),,對照組活細胞數(shù),X100%,=,結(jié)果：,方法： 細胞懸液加入酞酚藍染色液混勻，用細胞計數(shù)板，分別計數(shù)活細胞（未染色）和死細胞數(shù)目（藍色）,２. 誘導(dǎo)腫瘤細胞分化實驗,NBT還原法原理：硝基藍四氮唑蘭(NBT) 還原法測定細胞株分化　　　　誘導(dǎo)。正常的中性粒細胞內(nèi)磷酸戊糖支路活躍, 　　　　細胞內(nèi)還原型輔酶含量增加, 將可溶性NBT還原　　　　為不溶性藍紫色顆粒, 而沉

22、積于細胞漿內(nèi)。方法：HL-60 細胞株是篩選分化誘導(dǎo)劑的,藥物作用后, 　　　　細胞形態(tài)向粒細胞方向分化。結(jié)果：顯微鏡計數(shù)NBT還原陽性細胞，計算誘導(dǎo)分化率,對照組,藥物處理組,３. 誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡實驗,Ａ）形態(tài)學(xué)觀察（透射電鏡）原理：細胞超微結(jié)構(gòu)觀察方法：藥物處理后，收集細胞，4%戊二醛固定2 h以上，PBS清洗，1%俄酸固定1 h,酒精丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹脂包埋，切片做成銅網(wǎng)，經(jīng)醋酸鈾、枸櫞酸鉛染色，透射電鏡下觀察拍照

23、。,,,對照組,凋亡細胞,,正常細胞胞質(zhì)散在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核膜清楚、染色質(zhì)均勻、核仁明顯。,凋亡細胞染色質(zhì)濃縮、致密，沿核分布形成新月體狀，有凋亡小體出現(xiàn)。,對照組,,壞死,線粒體腫脹,凋亡細胞胞質(zhì)出現(xiàn)明顯的線粒體腫脹。,,壞死細胞細胞膜不完整，核膜破裂，染色質(zhì)呈蟲蝕狀溶解。,B）DNA形態(tài)觀察（Hoeschst333258）原理： Hoeschst333258與DNA特異性結(jié)合發(fā)出藍色熒光方法：腫瘤細胞用Hoeschst333258染

24、色后，在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果：活細胞成均勻的淡熒光，調(diào)亡細胞核或細胞質(zhì)內(nèi)可見強熒光的顆粒狀物質(zhì)。,對照組,藥物處理組,C）染色體ＤＮＡ斷裂測定,原理：凋亡細胞內(nèi)源性核酸酶激活，ＤＮＡ鏈被切割成200 bp不同倍數(shù)的片段，將這些片斷進行電泳，可觀察到ＤＮＡ梯帶方法：裂解腫瘤細胞，消化蛋白，提取ＤＮＡ，上凝膠電泳，ＥＢ染色后，ＵＶ燈下觀察。結(jié)果：凋亡細胞顯示ＤＮＡ梯帶。,,CTL,DRUG1,DRUG2,MARKER,３）PI/Ann

25、exin-Ｖ-FITC雙染色分析,原理：調(diào)亡細胞磷脂酰絲氨酸（PS）暴露于細胞　　　　　表面，PS結(jié)合標記熒光素FITC的Annexin-V　　　　　但細胞膜仍然完整，熒光染料ＰＩ不能進 入，而調(diào)亡晚期的細胞可同時受Annexin-V 和PI的雙標記?！　　　　　?方法：腫瘤細胞同時加入Annexin-Ｖ和ＰＩ染色，　　　　　用流式細胞儀分析。,正常細胞Annexin-V (-)

26、PI (-),晚期凋亡細胞Annexin-V (+)PI (+),早期凋亡細胞Annexin-V (+)PI (-),,,,,Annexin-V,PI,PI/AnnexinV-FITC 雙染激光共聚焦分析結(jié)果,,PI紅色熒光細胞核,AnnexinV-FITC綠色熒光細胞膜,,Annexin-V-FITC,PI,對照組,藥物處理組,４. 抗腫瘤

27、血管生成實驗,腫瘤發(fā)生、生長和轉(zhuǎn)移與新生血管形成密切相關(guān)，當腫瘤直徑超過2 mm時,直接由微環(huán)境提供的營養(yǎng)就不能滿足其生長需要,此時腫瘤的生長依賴于新生血管運送營養(yǎng)物質(zhì)。　 腫瘤血管生成抑制劑能抑制血管生成,阻止腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，在治療腫瘤中具有高效、廣普、副作用小、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點。,１）血管內(nèi)皮細胞體外篩選模型,原理：體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細胞在含生長因子條件下 能形成細胞條索，然后形成管狀。腫瘤

28、血管生 成抑制劑能抑制細胞管腔的形成。方法：人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞在含有藥物和不含有TAI 藥物的膠原凝膠中分別培養(yǎng)后,在顯微鏡下比較 它們形成的管腔數(shù)目。,對照組,藥物處理組,２）雞胚絨毛尿囊膜血管新生模型,原理：雞卵在胚胎發(fā)育過程中，尿囊膜上的血管生長　　　　很旺盛，將不同藥物作用于尿囊膜，觀察該膜　　　　上的血管生長。方法：雞胚

29、胎放在直培養(yǎng)皿內(nèi), 在無菌恒溫箱中孵育　　　　到第9 天的生長高峰時,將浸泡過藥物 的明膠　　　　海綿置于雞胚絨毛尿囊膜表面，培養(yǎng)２天，在　　　　顯微鏡下隨機取幾個視野點,記數(shù)“熱點”區(qū)的新　　　　生血管數(shù),計算平均值。,,血管生成抑制率（%）,對照組血管面積－給藥組血管面積,對照組血管面積,X100%,,＝,結(jié)果：,CTL,低劑量藥物,高劑量藥物組,３）斑馬魚血管新生模型,斑馬魚被廣泛地應(yīng)用于藥物篩選方面的研究。主要用于篩選

30、抗血管生成藥物?！?其胚胎早期發(fā)育的過程中,血管生成的模式比較簡單, 主要出現(xiàn)在頭部和軀干部體節(jié)間,體節(jié)間的血管最初由背部的動脈出芽形成于相鄰體節(jié)之間。,斑馬魚胚胎,方法：在96 孔板上用藥物處理胚胎,通過血管內(nèi)源　　　　 性堿性磷酸酶染色來顯示血管,進而評價藥　　　　物對血管生成的作用。結(jié)果：,５耐藥性逆轉(zhuǎn)實驗,腫瘤細胞耐藥性，分先天性耐藥性和獲得性耐藥性，也可分為原藥耐藥性和多藥耐藥性。多藥耐藥性基因mdr

31、1編碼表達P-糖蛋白（P-gp）是產(chǎn)生耐藥性的主要機制。P-gp將化療藥物泵出體外，降低藥物在細胞內(nèi)的濃度。 １）腫瘤耐藥性體外模型的建立　 逐步增加腫瘤細胞培養(yǎng)基中抗癌藥物的濃度（Dox）誘導(dǎo)產(chǎn)生腫瘤耐藥株。用MTT法檢測藥物對敏感株和耐藥株的細胞毒性，同時測定mdr1基因和P-gp表達水平。,,耐藥株,,,敏感株,,P-gp,敏感株,耐藥株,2) 逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性作用的藥物篩選,方法：采用MTT法測定加逆轉(zhuǎn)劑

32、前后DOX對耐藥株的細胞 毒性。計算逆轉(zhuǎn)效果.,FR (逆轉(zhuǎn)倍數(shù))=,,IC50(不加逆轉(zhuǎn)劑) / IC50(加逆轉(zhuǎn)劑）,Effect of NSC23925 to reverse drug resisitance in MDR cell lines,用熒光酶標儀、熒光顯微鏡或流式細胞儀檢測加藥前后耐藥細胞株內(nèi)抗癌藥多柔比星Dox的含量。,,,Control,,,,,0.5 uM Dox +1 uM Vep,0

33、.5 uM Dox,0.5 uM Dox +5 uM Vep,0.5 uM Dox +10 uM Vep,HepG/ADM Control,Verapamil 5 mM,Drug 1.25 mM,Drug 2.5 mM,Drug 5 mM,多柔比星累積實驗,Rhm123累積實驗,Control,Verapamil 5 mM,Drug 1.25 mM,Drug 2.5 mM,Drug 5 mM,6. 抗腫瘤侵襲和遷移實驗,轉(zhuǎn)移

34、是惡性腫瘤的重要特征腫瘤的遷移是一個多階段的復(fù)雜過程，Liotta等提出腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的三步學(xué)說，即粘附、降解和移動。粘附是腫瘤細胞侵襲的起始，腫瘤細胞通過表面特定受體與基底膜的層粘連蛋白、纖維連接蛋白和Ⅳ型膠原等相粘連，然后在蛋白水解酶和相關(guān)因子的作用下，侵襲基底膜，降解細胞外基質(zhì)腫瘤細胞一旦突破基底膜，逃避免疫監(jiān)視，即在基質(zhì)內(nèi)較快侵襲性生長并發(fā)生轉(zhuǎn)移。阻斷其中任何一個過程，都可以抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲,１）粘附實驗　原理：將

35、Matrigel鋪在96孔板上，能形成與天然基底膜極為相似的基底膜結(jié)構(gòu)，可以有效地在體外模擬腫瘤細胞的粘附過程。 方法：將Matrigel包被96孔板，過夜，將藥物處理后的細胞接種在96孔板，1h后，棄去未粘附的細胞，加入MTT培養(yǎng)，測定吸光度。 結(jié)果：,細胞粘附 抑制率（%）,=,（ OD對照-OD實驗）,,OD對照,X 100%,2）細胞劃痕實驗（運動能力檢測）,方法：細胞按30000個/孔密度接種于6

36、孔板，待細胞貼壁生長到90%融合度，用20 uL移液器槍頭在每孔劃出十字形劃痕，PBS清洗后，加入藥物處理后（無血清培養(yǎng)基），顯微鏡下觀察拍照。,,,,,A B C D EA: Control; B: Drug 20 nmol·L-1; C: Drug 30 nmol·L-1; D: Drug 40 nmol·

37、;L-1; E: Drug 50 nmol·L-1,細胞運動能力實驗,Transwell技術(shù),3）細胞遷移和侵襲實驗,原理：腫瘤細胞在趨化因子的作用下可 穿透聚碳酸酯膜，從上室轉(zhuǎn)移到下室，有些藥物可抑制這種遷移。,方法： （1）Transwell小室的制備 Matrix包被并水化基底膜（2）制備細胞懸液 1~10 x 105的細胞/200 uL（3）細胞接種 下室

38、20% FBS的培養(yǎng)液，上室無血清培養(yǎng)液（4）細胞培養(yǎng)24-48 h（5）細胞染色，拍照并計數(shù),,A: Control; B: Drug 20 nmol·L-1; C: Drug 30 nmol·L-1; D: Drug 40 nmol·L-1; E: Drug 50 nmol·L-1,細胞遷移能力實驗,細胞侵襲能力實驗,A: Control; B: Drug 20 nmol·L-

39、1; C: Drug 30 nmol·L-1; D: Drug 40 nmol·L-1; E: Drug 50 nmol·L-1,6.自噬實驗,自噬： 是以細胞器的自我消化和更新為特征生化過程過程： 粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫落的雙層膜包裹部分胞質(zhì)和細胞內(nèi)需降解的細胞器、蛋白質(zhì)等成分形成自噬體，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物，以實現(xiàn)細胞本身的代謝需要和某些細胞器的更新。 生物功能：一般

40、認為自噬是保護細胞，但是也可以誘導(dǎo)細胞 發(fā)生自噬性死亡。,自噬過程,自噬的特征,自噬的檢測,MDC法 原理：自噬小泡呈偏酸性，綠色的ＭＤＣ熒光 染料能選擇性聚集方法：加入ＭＤＣ（３ｍＭ）處理15min 后， 激光共聚焦顯微鏡觀察,LC3-GFP,原理：LC3-GFP綠色熒光蛋白克隆細胞株，出現(xiàn)自噬時伴隨LC3高表達，呈現(xiàn)綠色熒光染料方法：　

41、藥物處理預(yù)定時間后，激光共聚焦顯微鏡觀察,相關(guān)蛋白表達,LC3Atg5Beclin 1p62,四、酶水平的篩選,ＤＮＡ拓撲異構(gòu)酶抑制劑篩選 端粒酶酶抑制劑篩選 VEGFR 酪氨酸蛋白激酶酶抑制劑篩選 組蛋白去乙酰酶抑制劑篩選基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑篩選法基尼轉(zhuǎn)移酶抑制劑篩選絲裂原活化蛋白激酶抑制劑篩選,ＤＮＡ拓撲異構(gòu)酶抑制劑篩選,DNA拓撲異構(gòu)酶是一種重要的核酶，通過DNA鏈斷裂和重接而改變DNA的拓撲結(jié)構(gòu)，

42、調(diào)節(jié)其空間構(gòu)型變化，在細胞生長過程中起重要作用,方法：裂解細胞, 提取拓撲異構(gòu)酶, 測定酶總量或酶活 性的變化, 在酶反應(yīng)體系中，加入負超螺旋 pBR322 質(zhì)粒DNA, TOPO 酶提液及不同濃度的藥 物，溫育30 min后，加入反應(yīng)終止液，在瓊脂糖 凝膠中電泳, 溴化乙錠染色紫外燈下觀察。結(jié)果：,端粒酶抑制劑篩選,端粒是染色體特殊結(jié)構(gòu), 起著

43、保護染色體的完整和穩(wěn)定性的作用, 端粒酶是一種核糖核蛋白反轉(zhuǎn)錄酶, 可以自身RNA為模板合成端粒末端。正常細胞端粒酶活性是陰性, 而在腫瘤細胞株表達高活性。,方法：裂解細胞，提取蛋白，測定蛋白含量，ＰＣＲ　　　　擴增，凝膠電泳，銀染色結(jié)果：端粒是由短DNA 重復(fù)序列組成,而端粒酶的作　　　 用是維持端粒末端的長度,因此PCR 擴增產(chǎn)物　　　 間接反映端粒酶活性。,藥物對腫瘤細胞端粒長度和端粒酶活性

44、的影響,VEGFR酪氨酸蛋白激酶抑制劑篩選,VEGFR 受體酪氨酸蛋白激酶能特異性地將磷酸根轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)的酪氨酸殘基上使其磷酸化，酪氨酸激酶的異常表達還與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，腫瘤新生血管的生成，腫瘤的化療抗性密切相關(guān)。 以酪氨酸激酶為靶點進行藥物研發(fā)成為國際上抗腫瘤藥物研究的熱點。,受體酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)示意圖,腫瘤相關(guān)的受體酪氨酸激酶,ELISA方法： 以96孔酶標板作為實驗容器,加入包被

45、液谷氨酸酪氨酸多聚多肽，孵育過夜。加入受試物和酪氨酸激酶反應(yīng)1 h后，加入辣根過氧化物 酶標記的小鼠抗磷酸化酪 氨酸單克隆抗體,室溫反應(yīng) 30 min后, 用酶標儀讀 取吸光度(OD)值。,Q and A,試求出不同濃度ＮＡ對酪氨酸蛋白激酶的抑制率,組蛋白去乙酰酶抑制劑篩選,組蛋白是核小體的重要組成部分，組蛋白的乙?；?，DNA構(gòu)象易于展開，核小體的結(jié)構(gòu)松弛，利于轉(zhuǎn)錄因子和協(xié)同轉(zhuǎn)錄活化因子與DNA的接觸，激活基因轉(zhuǎn)錄過程

46、。,組蛋白乙酰化酶（HAC）和去乙?；福℉DAC）的協(xié)同調(diào)節(jié)作用決定了組蛋白和部分非組蛋白的乙酰化水平，是特定基因表達的切換開關(guān)。 組蛋白去乙?；敢种苿┛赏ㄟ^組蛋白和非組蛋白的乙?；?，阻斷細胞信號傳導(dǎo)途徑某些蛋白的活化，而發(fā)揮抗腫瘤活性。,原理：含乙酰化賴氨酸的短肽被HDAC區(qū)去乙酰 化后，發(fā)出熒光（353 nm 和448 nm）. Boc-(Ac)Lys-AMC + HDAC→

47、 Boc-Lys-AMC 無熒光 熒光 方法：在96孔板中依次加入反應(yīng)緩沖液、短肽 底物、HDAC酶以及不同濃度的抑制 劑，37℃孵育30-60 min，加入顯色液 終止反應(yīng)，用熒光酶標儀測定熒光強度,Trichostatin A抑制HDA

48、C酶活性,基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑篩選,基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）為膠原酶，是一種金屬離子依賴的蛋白酶，可有效降解基底膜的主要成分膠原及明膠，它的異常表達與惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。MMPs其主要功能是降解細胞外基質(zhì),參與血管形成、炎癥、腫瘤的侵潤及轉(zhuǎn)移等。,原理：熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（FRET） FRET肽段底物經(jīng)MMPs酶催化斷裂， EDAN片段發(fā)出熒光（340/

49、490 nm）,方法：在96孔或84孔板中依次加入反應(yīng)緩沖 液、FRET肽底物、MMP酶及抑制劑混 勻，5-60 min 內(nèi)連續(xù)測量熒光強度。試驗組設(shè)置: 陽性對照組（含MMP酶） 抑制劑組（含MMP酶和抑制劑） 溶劑對照組（含MMP酶和測試溶劑） 底物對照組（僅有底物） 測試藥物組（含M

50、MP酶和測試藥物）,法尼基轉(zhuǎn)移酶（Ras）抑制劑篩選,Ras蛋白是調(diào)節(jié)細胞生長和增殖的信號通路的重要元件, 是控制外來分子信號的分子開關(guān)。Ras蛋白以GDP結(jié)合和GTP結(jié)合兩種形式存在。,原理： (pull down assay) 活化形式的GTP-Ras與下游的效應(yīng)蛋白 Raf（Raf有Ras-binding domain，Raf- RBD）結(jié)

51、合。 Raf-RBD-GST融合蛋白固化谷胱甘肽親 和樹脂 （GSH），與含有GTP-Ras的樣 品孵育，Raf-RBD與GTP-Ras充分結(jié) 合，洗脫后，經(jīng)免疫印跡檢測Ras的表 達量。,GSH resin,GST,Raf-RBD,GTP-Ras,,Anti-Ras antibody,,絲裂原活

52、化蛋白激酶抑制劑篩選,絲裂原活化蛋白激酶是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，將細胞外刺激信號傳導(dǎo)到細胞核內(nèi)，并引起細胞的生物學(xué)反應(yīng)，如增殖、凋亡、分化等。主要有三條信號通路：ERK （Extracellular signal regulated kinase），JNK (c-Jun N-terminal kinase)和p38。,,,原理：生物大分子相互作用分析（Biacore） Biacore系統(tǒng)以無標記的檢測方式來

53、實時監(jiān) 測分子間的相互作用， 可觀察兩種分子結(jié) 合的特異性，能檢測到兩種分子的結(jié)合能 力，了解生物分子的結(jié)合過程共有多少個 協(xié)同者和參與者。,,,實驗方法：先將多種生物分子（MAPK酶等）固定 在傳感器芯片表面，將與之相互作用 的分子溶于溶液流過芯片表面。檢測

54、 器能跟蹤檢測溶液中的分子與芯片表 面的分子結(jié)合、解離整個過程的變化,,小 結(jié),動物水平篩選　　腹水瘤，S-180肉瘤，人癌裸鼠移植模型細胞水平篩選　 抗腫瘤增殖（MTT法， SRB法，排染試驗)　　分化誘導(dǎo)劑（NBT還原法）　　調(diào)亡誘導(dǎo)劑（Hoeschst，ＤＮＡ梯帶，Annexin-V/PI）　　血管生成抑制劑（人血管內(nèi)皮細胞，雞胚尿囊，斑馬魚）

55、　　耐藥性逆轉(zhuǎn)劑（Ｐ－ｇｐ抑制劑） 腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移抑制劑（Transwell） 自噬誘導(dǎo)劑（TEM， LC3， MDC）,,酶水平篩選　 ＤＮＡ拓撲異構(gòu)酶抑制劑篩選 端粒酶酶抑制劑篩選 VEGFR 酪氨酸蛋白激酶酶抑制劑篩選(ELISA) 組蛋白去乙酰酶抑制劑篩選 基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑篩選(FRET) 法基尼轉(zhuǎn)移酶抑制劑篩選(Pull do