組會匯報多殺菌素高產(chǎn)菌株發(fā)酵方面研究現(xiàn)狀匯報人

1、組會匯報,多殺菌素高產(chǎn)菌株發(fā)酵方面研究現(xiàn)狀匯報人：王美玲指導導師：盧文玉-,多殺菌素類化合物是由刺糖多孢菌經(jīng)有氧發(fā)酵后的次級代謝產(chǎn)物。本質(zhì)上屬大環(huán)內(nèi)酯類化合物，且沒有抑菌活性。純多殺菌素包含6種成分，其中組分A和D的活性最高。 刺糖多孢菌的培養(yǎng)溫度約為24-32℃，而產(chǎn)素的最適溫度為28-30℃。大規(guī)模發(fā)酵時應通過通氣量和攪拌速度來維持罐內(nèi)溶解氧在60％以上，最好為65％以上。罐內(nèi)壓力為0.034Mpa,,,,,,

2、,,,1、誘變突變株：菌絲誘變、萌發(fā)孢子誘變： 單一誘變和復合誘變2、抗性突變株：多殺菌素抗性突變株：（雙層培養(yǎng)法篩選）鼠李糖（初級代謝終產(chǎn)物、前體）3、耐代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似物突變株：慶大霉素、紅霉素、安普霉素4、誘變和抗性結(jié)合（多重迭代）5、耐C源分解代謝物阻遏突變　　　2-脫氧-D-葡萄糖6、原生質(zhì)體融合技術(shù),誘變劑,無論化學誘變劑還是物理誘變劑，單獨使用很少能收到預期的效果。所以生產(chǎn)中多采用幾種誘變劑復合

3、處理、交叉使用的方法UV 和氯化鋰(LiCl)復合誘變，硫酸二乙酯( D E S ) 誘變，亞硝基胍（N T G） 誘變，D E S和LiCl 復合誘變，60Co g 及137Cs g 誘變 、微波誘變、ＭＮＮＧLiCl 本身無誘變作用,原生質(zhì)體制備條件和再生研究（1）菌絲生長曲線（對數(shù)中期）（2）Gly對再生的影響（干擾細胞壁的形成）（3）溶菌酶、蝸牛酶、纖維素酶濃度、作用時間、溫度的影響（滲透壓、穩(wěn)定劑，Nacl、蔗糖）

4、（4）原生質(zhì)體的滅活（熱、紫外）（5）融合：（種間和種內(nèi)，與紅色糖多孢菌？）（不同分子量和濃度PEG、電融合）（6）再生培養(yǎng)基的選擇（瓊脂濃度）,培養(yǎng)基的優(yōu)化（發(fā)酵和種子培養(yǎng)基）,（1）單一C（N）源、復合C（N）源、有（無）機氮源、微量元素、均與設(shè)計實驗、正交試驗（2）響應曲面法單因素試驗 P-B試驗 SAS軟件分析 顯著因素 中心組合設(shè)計 響應面回歸分析 三維圖 最優(yōu)方案（3）研究C/N比對菌絲形態(tài)

5、和產(chǎn)量的影響（紅霉素）（4）搜集劑（磷鈣、沸石）對產(chǎn)量和PH影響 （銨離子）,,發(fā)酵條件優(yōu)化,1、種子液的影響接種量、種齡2、搖瓶發(fā)酵條件的優(yōu)化發(fā)酵周期的確定消前pH、搖瓶轉(zhuǎn)速以及搖瓶裝量進行正交設(shè)計實驗 變溫（4/5d）對產(chǎn)素的影響 (不)加玻璃珠對生物量和產(chǎn)量的影響3、初始濃度葡萄糖、磷酸鹽對菌體和產(chǎn)量的影響，磷酸鹽對葡萄糖的利用的影響葡萄糖效應：補糖時間的確定（流加）4、補加前體物質(zhì)的影響：加入時間和量,5

6、、接種方式的影響：種子（挖塊、菌絲、孢子）、發(fā)酵（一級和二級種子）（阿維霉素）6、短鏈脂肪酸（乙酸、丙酸等）作為緩效碳源加入時間的確定及影響7、DO、OUR、CER、RQ的相關(guān)分析8、硝酸銨（促進生長，降低產(chǎn)量）、磷酸二氫鉀（調(diào)節(jié)PH，ATP、磷酸酶）、正丙醇的影響9、混合脂肪酸代替豆油 （螺旋霉素）10、流加補料的時間、速率， 分批補料,,初篩(菌塊—TLC法),步驟：涂布 培養(yǎng) 浸提 點樣 層析 顯色

7、 比較（1、原理：斑點的有無和深淺（2、驗證顏色的深淺與濃度相關(guān)（即可行性）（3、展開劑的選擇（甲醇/丙酮）（4、檢測最低濃度、檢測范圍的確定（5、瓊脂塊的大小的確定設(shè)想：如果培養(yǎng)基中含有在含脂肪，以中性紅為檢測劑，測定脂肪酶的活性（產(chǎn)量和顏色成正比）,,,,,,,,,,復篩(HPLC法),發(fā)酵液的預處理：（油的多少）發(fā)酵液 離心 棄上清 浸提 離心 微孔濾膜過濾 HPLC根據(jù)分離度、拖尾因子確定：流動相、流速、進液

8、量，檢測波長。,,,,,,,,,,,,,,前體的推測研究,根據(jù)大環(huán)內(nèi)酯類青霉素為例：（聚酮反應）分支氨基酸和植物油分解產(chǎn)生短鏈脂肪酸（1）Asp、Gly、Met、Leu、Val是丙酰CoA的來源。異丁酸、丙酸、乙醇、甲醇、異丙醇、正丙醇、乙酸銨、丙酸鈉、丁酸鈉、檸檬酸鈉形成乙酰CoA、甲基丙二酰CoA、丙酰CoA等前體（2）最佳前體不同濃度和補加時間、補加方式的影響,提取條件的優(yōu)化：,單一溶媒（甲醇、丙酮、乙腈等）混合溶媒提取

9、（乙酸乙酯的作用）提取時間提取方法（超聲波、靜置）萃取次數(shù)被提物的選擇取（發(fā)酵液、菌體）,高產(chǎn)菌株生理特性的描述,菌落形態(tài)、菌絲形態(tài)、遺傳穩(wěn)定性、生化特性：生物量的測定：干重法，測核酸　還原糖的測定：DNS法可溶性氨基氮的測定：甲醛法/納氏試劑分光光度法磷酸鹽的測定：氯化亞錫分光光度法酸價的測定：游離脂肪酸的含量效價、ＰＨ及其他系數(shù)的測定成分Ａ、Ｄ比重,植物油在大環(huán)內(nèi)酯類抗生素中應用,（1）疏水性作為緩效碳源避免

10、葡萄糖效應（2）為短鏈脂肪酸的來源，為聚酮類提供前體（3）分解為脂肪酸和甘油分別經(jīng)β-氧化，EMP途徑合成乙酰輔酶A （4）消泡劑（5）避免使用黃豆餅粉，粘度大，產(chǎn)泡多（6）過量產(chǎn)生脂肪酸使PH下降（7）磷酸鎂的影響？（8）穩(wěn)定劑對油的利用（9）甲基丙二酰CoA羧基轉(zhuǎn)移酶、檸檬酸脫氫酶、脂肪酶活性大?。?0）脂肪酸種類、飽和程度、添加量和時間的影響,分批發(fā)酵動力學,測定生物量、培養(yǎng)液PH、葡萄糖消長、效價的變化趨勢利