頭孢菌素C高產菌株選育及發(fā)酵特性研究.pdf

1、本論文以頭孢菌素C產生菌頂頭孢霉菌為研究對象，通過傳統(tǒng)理化誘變選育、復合誘變選育、推理選育及遞歸原生質體融合（Genome shuffling）技術選育，篩選頭孢菌素C高產菌株，并進行相關發(fā)酵特性的研究和發(fā)酵條件優(yōu)化實驗，為頂頭孢霉工業(yè)生產提供了菌株優(yōu)化改良的實驗思路。
　　 首先，以頂頭孢霉ys-3為出發(fā)菌株通過紫外線、亞硝酸及其復合誘變技術進行菌種的初步優(yōu)化選育，摸索合適的誘變劑量，確定最佳紫外誘變條件為30 W紫外燈下15

2、 cm處照射120 s，亞硝酸誘變條件為亞硝酸濃度50 mmol/L，誘變處理120 s時為最佳，多輪次誘變積累，共挑選出879株誘變子，通過瓊脂柱托盤抑菌高通量篩選，獲得了高產菌株FH-127，較出發(fā)菌株抑菌圈直徑提高了80％。
　　 然后，以誘變菌株FH-127為出發(fā)菌株，根據頭孢菌素C的生物合成途徑，選擇丙二酸、重金屬銅離子和頭孢菌素C鈉鹽作為篩選耐受壓力，確定丙二酸、銅離子、頭孢菌素C鈉鹽濃度分別為1％、0.06％、8

3、g/L時為臨界耐受濃度，分別收集得到銅離子耐受菌株269株，丙二酸耐受菌株187株，終產物耐受菌株273株，經過瓊脂柱托盤抑菌實驗初篩，搖瓶發(fā)酵HPLC復篩，獲得高產耐受菌株T-01069、TB-69068、TBC-68187、TBC-68071，為下一步Genome shuffling融合奠定基礎。
　　 采用Genome Shuffling技術，對原生質體制備菌齡，酶解時間及高滲液的選擇進行優(yōu)化，確定了最佳原生質體制備條件和

4、再生方式，在30％ PEG 6000介導下對紫外和加熱雙親滅活的原生質體進行融合10 min，PDA培養(yǎng)基雙層平板再生，并將所得的性狀優(yōu)良突變株進行遞歸融合選育，瓊脂柱抑菌篩選并通過HPLC檢測，將選育出的多優(yōu)良性狀進行整合，獲得高產融合子G4-13，且比原始菌株產量提高101.4％。
　　 在對最終篩選出的高產菌株遺傳穩(wěn)定性實驗后，還研究了該菌株的發(fā)酵特性，首先分析了發(fā)酵過程中菌株對豆油的利用能力，降低了豆油添加量。隨后對豆油

5、進行了硅膠柱層析，初步分為極性、中極性和弱極性組分，通過比較發(fā)現中弱極性的組分更有利于頭孢菌素的合成。接下來還進行了發(fā)酵環(huán)境的優(yōu)化實驗，分別對其進行接種菌齡、發(fā)酵周期及發(fā)酵溫度優(yōu)化實驗，最終確定最佳優(yōu)化條件為：接種膨大菌絲階段時期菌種，控制發(fā)酵溫度前期28 ℃，后期25 ℃，發(fā)酵136 h后，此條件HPLC檢測頭孢菌素C的含量最大。通過發(fā)酵特性優(yōu)化實驗，最終減短頂頭孢霉發(fā)酵周期，降低生產頭孢菌素C發(fā)酵過程中的豆油添加量和動力高耗問題，為