抗菌藥物敏感試驗

1、第四章 抗菌藥物的敏感性試驗藥敏試驗的意義1、可預(yù)測抗菌治療的效果2、指導(dǎo)臨床抗菌藥物的使用3、發(fā)現(xiàn)或提示細菌耐藥機制，幫助臨床醫(yī)生合理使用抗菌藥物4、監(jiān)測細菌的耐用性，分析耐藥菌的變化，預(yù)防和控制耐藥菌感染的發(fā)生和流行,抗菌藥物的敏感性試驗,常用方法：,紙片擴散法微量液體稀釋法E-TEST法,原理： 將含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測試菌的瓊脂平板上，紙片中所含的藥物吸收瓊脂中水分溶解后不斷向紙片周圍擴

2、散形成遞減的梯度濃度，在紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)測試菌的生長被抑制，從而形成無菌生長的透明圈即為抑菌圈。 抑菌圈的大小反映測試菌對測定藥物的敏感程度，并與該藥對測試菌的MIC呈負相關(guān)。,紙片擴散法（Kirby-Bauer法）,操作方法 ：1.將在約56℃恒溫的無菌M-H（水解硌蛋白）瓊脂傾注直徑為90mm的平板，其厚度 4mm。,2.無菌挑取孵育16～24h的血平板上4~5個菌落。,3.置于無菌生理鹽水中，校正其濁度于Mc

3、Farland No 0.5管。,4.用無菌棉簽浸入細菌懸液中，將拭子在試管上壁輕輕擠壓以擠去過多的菌液。棉簽在三個方向均勻抹瓊脂表面（每次轉(zhuǎn)60℃）使菌液均勻分布，最后沿平板內(nèi)緣涂抹一周。,5.蓋上平板的蓋子，放置培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，放置3~10分鐘 后貼上標準抗生素紙片。,6.根據(jù)選擇的菌株挑選相應(yīng)的抗菌紙片。腸桿菌科：氨芐西林、阿米卡星、哌拉西林/ 他唑巴坦、頭孢噻肟、環(huán)丙沙星、亞胺培

4、南、氨曲南、慶大霉素；銅綠假單胞菌：頭孢他啶、慶大霉素、哌拉西林、 阿米卡星、環(huán)丙沙星、頭孢吡肟、亞胺培南；葡萄球菌屬：頭孢西丁、青霉素、紅霉素、萬古霉 素、環(huán)丙沙星、慶大霉素、利福平 ；,腸球菌屬：青霉素 、萬古霉素 、甲氧芐啶/磺胺異 噁唑 、慶大霉素、環(huán)丙沙星、紅霉素、氨芐西林不動桿菌屬：頭孢他啶 、亞胺培南、阿米卡星、哌拉 西林/他唑巴坦、頭孢吡肟 、頭孢曲松 、環(huán)丙沙

5、 星、米諾環(huán)素；洋蔥伯克霍德菌：頭孢他啶 、米諾環(huán)素、甲氧芐啶/磺 胺異噁唑 、美羅培南 ；,嗜麥芽窄食單胞菌：甲氧芐啶/磺胺異噁唑、左氧氟沙 星、米諾環(huán)素 ；嗜血桿菌屬：氨芐西林、甲氧芐啶/磺胺異噁唑、頭孢 他啶、美羅培南、阿奇霉素、環(huán)丙沙星、頭孢克洛；淋病奈瑟菌：頭孢曲松、環(huán)丙沙星、青霉素、大觀霉素、 四環(huán)素 ；肺炎鏈球菌：紅霉素 、苯唑西林 、甲氧芐啶/磺胺異噁唑、克林霉素

6、、左氧氟沙星、四環(huán)素、萬古霉素 ； 除肺炎鏈球菌外的其他鏈球菌：紅霉素、青霉素、克林霉素、萬古霉素、頭孢曲松、左氧氟沙星。,7.用無菌鑷子或紙片分配器將抗菌紙片粘貼于M-H瓊脂 的表面，一旦紙片貼上，不能移動；各抗菌紙片中 心距離應(yīng)大于24mm，紙片距平板內(nèi)緣應(yīng)大于15mm。,8.經(jīng)過35℃16～24h孵育。,9.取抑菌環(huán)直徑，根據(jù) CLSI（clinical and laboratory sta

7、ndards institute ）標準，報 告細菌對該抗生素 敏感(susceptible,S)、 耐藥(resistant,R)、 中介(intermediate,I)。,原理： 聚乙烯板內(nèi)含有各種稀釋度的抗菌藥物，實驗時加入100μl濃度為105 CFU/ml的菌液，蓋上蓋板，35℃16～20h觀察結(jié)果?？椎撞壳逦怀霈F(xiàn)細菌沉淀的最低抗菌藥物濃度即為該抗菌藥物對細菌的最小抑菌濃度，通過CLSI標

8、準判斷其敏感和耐藥。再取0.01ml容量接種環(huán)取肉眼觀察無菌生長的液體接種于血瓊脂平板作次代培養(yǎng)，經(jīng)35℃過夜培養(yǎng)后觀察最低抗菌藥物濃度能殺死99.9％原始種入的細菌即為該菌的最低殺菌濃度(MBC)。,微量液體稀釋法 (microdilution test),操作方法：1.抗菌藥物的稀釋和融解,2.抗菌藥物母液的稀釋,3.在微量聚乙烯微板孔中加入各種不同濃度的抗生素 100μl，從低濃度往高濃度加樣，不需要更換吸管。,4.挑選

9、18~24小時的菌落置M-H肉湯增菌4~6小時。,5.制備0.5麥氏比濁管，然后1:200稀釋，使之最終 濃度105 CFU/ml。,6.用微量加樣器接種100μl 到96孔中，蓋上蓋板。 同時作陽性、陰性對照。,7.手工看濁度或儀器自動 判讀。按照CLSI標準報 告細菌對某抗菌藥物為 敏感、耐藥和中介。,原理： E試條是一條5mm×50mm無孔試劑載體，一面固定有一系列預(yù)先制備的濃度

10、呈連續(xù)指數(shù)增長稀釋抗菌藥物，另一面有讀數(shù)和判別的刻度。抗菌藥物的梯度可覆蓋有20個MIC對倍稀釋濃度的寬度范圍。將E試條放在細菌接種過的瓊脂平板上，經(jīng)孵育過夜，圍繞試條明顯可見橢圓形抑菌圈，圈的邊緣與試條交點的刻度濃度即為抗菌藥物抑制細菌的最小抑菌濃度，對照CLSI標準判斷其敏感、耐藥、中介。,E-TEST,1.挑取16～20h的菌落2.用無菌生理鹽水制備成0.5麥氏比濁管濁度的菌液。,操作方法：,3.用無菌棉簽浸入細菌懸

11、液中，將拭子在試管上壁輕輕擠壓以擠去過多的菌液。棉簽在三個方向平均涂抹瓊脂表面（每次轉(zhuǎn)60℃）使菌液均勻分布，最后沿平板內(nèi)緣涂抹一周。,4.用鑷子將E-TEST試條的抗菌藥物的一面貼向瓊脂表 面，有刻度的一面向外，直徑140mm的平板可放置 6條，90mm平板只能放置1～2試條 。5.孵育，置平板于35℃孵育16～24h。,6.孵育后形成一橢圓形抑菌圈，抑菌圈和試條的相交 處的刻度即為抗菌藥物對該菌的最低抑菌濃度(M

12、IC) 。,第九節(jié) 細菌的分類命名,一、分類原則:細菌的分類原則上分為傳統(tǒng)分類和種系分類。,分類方法：（1）人為分類法： 以細菌形態(tài)和生理生化特征為依據(jù)，分為： 傳統(tǒng)分類法 和 數(shù)值分類法（2）系統(tǒng)分類法：以細菌大分子物質(zhì)（核酸、蛋白質(zhì)）結(jié)構(gòu)的同源程度進行分類，稱為種系分類或自然分類,具體到細菌鑒定和分類的方法包括⒈表型分類：以細菌的形態(tài)和生理特征為依據(jù)的分類方法，即選擇一些較為穩(wěn)定的生物學(xué)性

13、狀，如菌體形態(tài)與結(jié)構(gòu)、染色性、培養(yǎng)特性、生化反應(yīng)、抗原性等作為分類的標記，它奠定了傳統(tǒng)分類的基礎(chǔ)。,⒉分析分類：應(yīng)用電泳、色譜、質(zhì)譜等方法，對菌體組分、代謝產(chǎn)物組成與圖譜等特征進行分析，為揭示細菌表型差異提供了有力的手段。,⒊基因型分類：分析細菌的遺傳物質(zhì)，揭示了細菌進化的信息，是最精確的分類方法。包括DNA堿基組成（G+C mol%）、核酸分子雜交（DNA-DNA同源性、DNA-rRNA同源性）和16S rRNA同源性進行分析。其中1

14、6S rRNA更為重要，因其在進化過程中保守、穩(wěn)定，很少發(fā)生變異，是種系分類的重要依據(jù)。,國際上最具權(quán)威性的細菌分類系統(tǒng)專著《伯杰氏系統(tǒng)細菌學(xué)手冊》（1984）和《伯杰氏鑒定細菌學(xué)手冊》（第9版，1994）都已反映了細菌種系分類的研究進展。最新出版的《伯杰氏系統(tǒng)細菌學(xué)手冊》（第2版，2004）已收集了4000余種模式菌株的16S rRNA序列，將原核生物分為兩個域，即古生菌域和細菌域，前者分為2個門，后者分為24個門，依次再分為綱、目、

15、科、屬、種。,細菌與生物分類相同: 介、門、綱、屬、種、型,分類：屬（genus）, 種（species） 型（type）， 株（strain）,二、種、型、株的概念,種（species）：生物學(xué)性狀相似的群體 組成，是細菌分類的最基本單位,型（type）：同一種細菌也存在有差異 差異小者稱型; 差異大

16、者稱亞種或變種,株（strain）：不同來源的同一種細菌稱株,標準株（standard strain ）：　　　　通過生化反應(yīng)和血清學(xué)鑒定 　的,具有某種細菌典型特征， 　　 中科院保存的菌株。也稱模式株,命名：拉丁文雙名法即屬名在前,種名在后,Staphylococcus aureus ：金黃色葡萄球菌簡寫：Ｓ． aureus,Mycobacterium tuberculos