誘導(dǎo)多功能性干細(xì)胞-汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)精品課程

1、誘導(dǎo)產(chǎn)生多能性干細(xì)胞的研究,里程碑式的科學(xué)突破,細(xì)胞重編程的研究概況,核移植,核移植試驗(yàn)最初是在兩棲動(dòng)物中實(shí)現(xiàn)的，通過(guò)將體細(xì)胞核注入到去核卵母細(xì)胞中。迄今，人們已經(jīng)獲得了多種核移植動(dòng)物，也建立了來(lái)源于核移植胚胎的胚胎干細(xì)胞系。,體細(xì)胞核移植試驗(yàn)也具有很大的局限性,克隆的效率極低產(chǎn)生的許多后代在各個(gè)階段都體現(xiàn)出嚴(yán)重的發(fā)育異常由于需要卵母細(xì)胞，核移植實(shí)驗(yàn)在人類中的應(yīng)用受到強(qiáng)烈的倫理學(xué)質(zhì)疑這些不足，都制約了核移植技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展和應(yīng)用

2、。,將成熟的體細(xì)胞與多潛能的細(xì)胞（ES細(xì)胞、胚胎癌細(xì)胞等）融合，或者用胚胎干細(xì)胞提取物來(lái)處理體細(xì)胞，也可以在一定程度上使體細(xì)胞發(fā)生重編程。,利用這兩種方法，可以實(shí)現(xiàn)某些多功能性標(biāo)志分子的重新表達(dá)和多種分化潛能的獲得。但是，體細(xì)胞與多能性細(xì)胞的融合率較低，融合之后的細(xì)胞具有兩套染色體，并且在移植后會(huì)發(fā)生排斥現(xiàn)象，這就制約了細(xì)胞融合的臨床應(yīng)用。,有沒(méi)有相對(duì)簡(jiǎn)單，又可擺脫材料來(lái)源和倫理學(xué)諸多限制，重編程的效率和程度都十分可觀的新方法呢？,里

3、程碑式的科學(xué)突破,2006年11月20日，日本京都大學(xué)的山中伸彌（Shinya Yamanaka)和美國(guó)威斯康星大學(xué)的詹姆斯·湯姆森（James Thomson）分別在《細(xì)胞》和《科學(xué)》雜志上發(fā)表重量級(jí)論文，宣布他們用基因改造的手段，將人類體細(xì)胞改造成了類胚胎干細(xì)胞，在功能上幾乎可以和胚胎干細(xì)胞相媲美。,詹姆斯·湯姆森小組的論文發(fā)表在11月20日的《科學(xué)》雜志上,俞君英是11月20日《科學(xué)》雜志論文的第一作者,200

4、6年8月，日本科學(xué)家山中伸彌小組首先在小鼠身上取得成功,誘導(dǎo)產(chǎn)生的多功能性干細(xì)胞,2006年，Takahashi 和 Yamnaka 將幾個(gè)轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入已分化的小鼠皮膚成纖維細(xì)胞，進(jìn)而獲得了類似于胚胎干細(xì)胞的多能性干細(xì)胞，稱之為“誘導(dǎo)產(chǎn)生的多功能性干細(xì)胞”（induced pluripotent stem cells,iPS細(xì)胞）。這一研究明確地證實(shí)了分化的細(xì)胞可以通過(guò)少數(shù)幾個(gè)因子的外源導(dǎo)入而被重編程到具有多能性的狀態(tài)，因而受到了整個(gè)生

5、命科學(xué)領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。,在研究誘導(dǎo)多功能性干細(xì)胞產(chǎn)生的原理機(jī)制之前，先了解一下體細(xì)胞重編程逆轉(zhuǎn)為干細(xì)胞的研究進(jìn)展,體細(xì)胞重編程的過(guò)程體細(xì)胞重編程的原理體細(xì)胞不經(jīng)過(guò)胚胎逆轉(zhuǎn)為多能干細(xì)胞的方法,成體細(xì)胞核的重編程,1.核重編程：核移植后供體核停止本身的基因表達(dá)程序，恢復(fù)為胚胎發(fā)育所必需的胚胎化基因表達(dá)程序狀態(tài)。此過(guò)程包括：染色體結(jié)構(gòu)重建、DNA甲基化、組蛋白乙酰化、印記基因表達(dá)、端粒長(zhǎng)度恢復(fù)、X染色體失活等。,,1.1.DNA甲基化

6、 1.2.合子型基因的重新激活，如：Oct-42.重塑核結(jié)構(gòu) 主要有包括核纖層A、B、C三種核纖層蛋白的重塑,,,3.細(xì)胞質(zhì)重編程—miRNA,miRNA是決定細(xì)胞分化方向的因子。 細(xì)胞中miRNA成分的改變能提高細(xì)胞對(duì)調(diào)節(jié)基因表達(dá)重編程。,,接下來(lái)，介紹一下體細(xì)胞重編程不經(jīng)過(guò)胚胎逆轉(zhuǎn)為多能干細(xì)胞的方法之一：通過(guò)特定基因的表達(dá)將體細(xì)胞重編程過(guò)程逆轉(zhuǎn)為干細(xì)胞。“基因重新編排技術(shù)”，借助“逆轉(zhuǎn)錄酶病毒”為載體,即向皮膚細(xì)胞中植入

7、一組4個(gè)基因 (Oct4,Sox2,c-myc和Klf4 )，通過(guò)基因重新編排，使皮膚細(xì)胞具備胚胎干細(xì)胞的功能。這種被改造過(guò)的細(xì)胞稱作“iPS細(xì)胞”。,,下面簡(jiǎn)單介紹一下這些研究中所用到的多能性相關(guān)因子Oct4,Sox2,c-myc和Klf4在多能性調(diào)控中的作用。,1.Oct3/4,Oct-4（也稱Oct-3）屬于POU轉(zhuǎn)錄因子家族的一員[1~3] 。是哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育的一個(gè)關(guān)鍵的調(diào)控因子。是全能性的標(biāo)志，它能夠促使ICM形成、維持

8、胚胎干細(xì)胞未分化前狀態(tài)并促進(jìn)其增殖。,2.SOX2基因,SOX2基因是編碼轉(zhuǎn)錄因子的主控基因（master genes）家族的一個(gè)成員。轉(zhuǎn)錄因子是些與DNA結(jié)合并調(diào)節(jié)其他基因表達(dá)的蛋白質(zhì),3.癌癥基因c-MYC,癌癥基因c-MYC，是一種最容易過(guò)渡表現(xiàn)于人類的致癌基因，它對(duì)某些成體干細(xì)胞的自我更新起一定的作用，并可以抑制ES細(xì)胞的分化。,4.Klf4,Krueppel-like factor 4，KLF4上皮鋅指轉(zhuǎn)錄因子Klf4 (舊稱

9、GKLF)調(diào)節(jié)體外細(xì)胞的增生與分化,iPS細(xì)胞誘導(dǎo)機(jī)制,,已分化的細(xì)胞,,導(dǎo)入病毒基因Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4,病毒逆轉(zhuǎn)錄,,胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)條件和篩選,Ips細(xì)胞,誘導(dǎo)多功能細(xì)胞,,,,,我們已經(jīng)了解了體細(xì)胞重編程的原理和誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞的產(chǎn)生機(jī)制，下面讓我們?cè)偕钊肓私庖幌翴ps細(xì)胞的研究概況和Ips細(xì)胞系建立的一些重要環(huán)節(jié)。,Ips細(xì)胞的研究概況（研究方法）,這是一種具有很強(qiáng)創(chuàng)新性的研究方法：通過(guò)外源導(dǎo)入與多功能

10、相關(guān)并且能使重組細(xì)胞恢復(fù)全能性的轉(zhuǎn)錄基因來(lái)誘導(dǎo)體細(xì)胞核發(fā)生重新編程，從而使體細(xì)胞轉(zhuǎn)變成多能性干細(xì)胞。,這種方法所受的啟示來(lái)源于“ ES細(xì)胞-體細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)”。細(xì)胞的多能性收到許多因子精密而又復(fù)雜的調(diào)控。ES細(xì)胞和體細(xì)胞融合后能誘導(dǎo)體細(xì)胞核的重新編程，ES細(xì)胞中存在著一些因子，這些因子對(duì)于多能性的建立可能至關(guān)重要。,,,Ips細(xì)胞的研究概況（兩個(gè)相關(guān)實(shí)驗(yàn)）,Ips細(xì)胞首先由科學(xué)家Takahashi和Yamanaka在2006年建立的。實(shí)驗(yàn)

11、原理如下：利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在小鼠成纖維細(xì)胞中導(dǎo)入了4個(gè)與多功能性有關(guān)的基因：Oct4,Sox2,c-myc和Klf4。利用多能性標(biāo)志分子Fbx15的表達(dá)對(duì)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行了篩選，最終的到了ips細(xì)胞，這種細(xì)胞的功能和性能幾乎和胚胎干細(xì)胞一樣。,另一個(gè)實(shí)驗(yàn)的對(duì)象是人類皮膚成纖維細(xì)胞的重編程，而實(shí)驗(yàn)的過(guò)程和上一個(gè)實(shí)驗(yàn)基本相同；。只是對(duì)所篩選的轉(zhuǎn)錄基因做了一下修飾：去掉了腫瘤相關(guān)因子c-Myc，使ips細(xì)胞的生產(chǎn)更加安全,Ips細(xì)胞系建立的

12、一些重要環(huán)節(jié)（幾種因子的發(fā)現(xiàn)過(guò)程）,日本科學(xué)家發(fā)現(xiàn)ES細(xì)胞中那個(gè)存在著一些因子，這些因子對(duì)于多能性的建立可能至關(guān)重要?？茖W(xué)家對(duì)24個(gè)與多能性維持相關(guān)的候選基因?qū)胄∈蟪衫w維細(xì)胞中，依次去掉其中一個(gè)基因，最后在得到的10個(gè)基因中發(fā)現(xiàn)了4個(gè)至關(guān)重要的基因，其中任何一個(gè)缺失都將導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)的失敗，這4個(gè)基因中的任意2個(gè)或3個(gè)組合都無(wú)法形成具有ES細(xì)胞特性的ips細(xì)胞。從而確定了：Oct4,Sox2,c-myc和Klf4這4種基因,人類ES細(xì)胞能

13、夠通過(guò)細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)室體細(xì)胞發(fā)生重編程。美國(guó)科學(xué)家比較了人類ES細(xì)胞和髓前體細(xì)胞的基因表達(dá)譜，挑選出許多在ES細(xì)胞和髓前體細(xì)胞的基因表達(dá)譜，挑選出許多在ES細(xì)胞中相對(duì)高表達(dá)的基因。再根據(jù)這些基因在多能性調(diào)控中的已知功能對(duì)其進(jìn)行了排序，從中選出14個(gè)候選基因。將這些基因以不同的組合方式導(dǎo)入一種由人類ES細(xì)胞分化得到的間充質(zhì)樣細(xì)胞后，檢驗(yàn)了不同基因的導(dǎo)入對(duì)這種細(xì)胞重編程的作用。最后鎖定了4種因子：Oct4,Sox2,Nanog,Lin28.,

14、Ips細(xì)胞系建立的一些重要環(huán)節(jié)（Ips細(xì)胞的篩選）,Ips細(xì)胞的篩選：主要有三種方法：形態(tài)學(xué)篩選、藥物篩選和選用對(duì)多能性更為關(guān)鍵的基因作為報(bào)告基因。其中利用Fbx15對(duì)ips細(xì)胞進(jìn)行篩選，原理是Fbx25對(duì)于多能性的維持和胚胎的發(fā)育來(lái)說(shuō)是不可缺少的基因，所以Fbx25作為篩選ips細(xì)胞的報(bào)告基因。 僅利用形態(tài)學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)代替報(bào)告基因的篩選。Maherali等人發(fā)現(xiàn)，僅僅依靠形態(tài)學(xué)篩選可能就足以建立ips細(xì)胞系。后來(lái)的研究證實(shí)了在

15、不對(duì)供體細(xì)胞做任何額外遺傳修飾的情況下，僅依靠形態(tài)學(xué)篩選的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行篩選也能夠分離出小鼠的ips細(xì)胞。利用基因重組技術(shù)建立了具有藥物抗性基因的體細(xì)胞，這些細(xì)胞的抗性受內(nèi)源性Nanog或Oct4表達(dá)的調(diào)控。這兩個(gè)基因的作用是維持細(xì)胞多能性，從而利用這種篩選的方法建立了穩(wěn)定的ips細(xì)胞系，這些細(xì)胞系在各個(gè)方面都表現(xiàn)出了極為相似的特性。,iPS細(xì)胞的應(yīng)用價(jià)值和發(fā)展方向,1、利用iPS細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，只操縱幾個(gè)因子的表達(dá)，加速對(duì)多能性

16、調(diào)控機(jī)理的深入研究。2、獲得的方法相對(duì)簡(jiǎn)單穩(wěn)定，不涉及胚胎的破壞，無(wú)倫理道德限制。3、對(duì)于疾病機(jī)理研究和新藥開(kāi)發(fā)等方面將有很大貢獻(xiàn)。4、可望制造特定病人來(lái)源的iPS細(xì)胞，用“個(gè)性化”移植來(lái)治療諸多疾病。,誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞用于治療小鼠帕金森病,美國(guó)麻省Whitehead生物醫(yī)學(xué)研究的Wernig等近日?qǐng)?bào)告,通過(guò)Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四種轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)出的iPS細(xì)胞可分化成神經(jīng)細(xì)胞,可改善帕金森病小鼠的運(yùn)動(dòng)功能。,研究

17、者首先檢驗(yàn)了iPS細(xì)胞在體外的分化能力,發(fā)現(xiàn)iPS細(xì)胞可以分化成神經(jīng)元細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,并且能夠進(jìn)一步生成神經(jīng)元亞型細(xì)胞,,,未分化的iPS細(xì)胞,iPS細(xì)胞在體外分化成神經(jīng)細(xì)胞,隨后,研究者用熒光物質(zhì)標(biāo)記iPS細(xì)胞,將其入注射入胚胎小鼠的腦室內(nèi)。9周后(小鼠出生后),研究者發(fā)現(xiàn),iPS細(xì)胞可遷移到小鼠腦的各個(gè)區(qū)域。,包括腦膜、紋狀體、下丘腦、中腦等部分,并且可分化成神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元,包括谷氨酸性突觸、γ氨基丁酸能神經(jīng)元和兒茶氨酚能

18、神經(jīng)元等亞型,因?yàn)檫@些分化出的細(xì)胞具有神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài),并且表達(dá)其特異的標(biāo)志物,iPS細(xì)胞植入小鼠大腦后的分布情況,iPS細(xì)胞分化的細(xì)胞具有神經(jīng)細(xì)胞形態(tài),iPS細(xì)胞分化的細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞特異標(biāo)志物,電生理記錄和形態(tài)學(xué)分析表明,iPS細(xì)胞分化出的神經(jīng)元細(xì)胞植入小鼠體內(nèi)后,具有神經(jīng)元和突觸的形態(tài),參與小鼠的電生理活動(dòng)，因而可增強(qiáng)受植小鼠大腦的神經(jīng)元活性并參與腦功能。,iPS細(xì)胞分化出的神經(jīng)元細(xì)胞可發(fā)生膜電位改變,研究者對(duì)小鼠大腦一側(cè)注射神經(jīng)毒

19、性物質(zhì)6-羥基多巴胺,使該側(cè)內(nèi)產(chǎn)生神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺的神經(jīng)元死亡。這可破壞該側(cè)大腦紋狀體,即大腦中負(fù)責(zé)運(yùn)動(dòng)控制的區(qū)域,模擬了帕金森病發(fā)生時(shí)的情況。經(jīng)過(guò)這樣處理的小鼠運(yùn)動(dòng)控制功能受損,因此無(wú)法保持平衡而持續(xù)旋轉(zhuǎn)。,接著，研究者對(duì)iPS細(xì)胞進(jìn)行特殊處理,確保這些iPS分化成為多巴胺能神經(jīng)元,將其植入小鼠大腦運(yùn)動(dòng)功能受損的一側(cè)(接受6-羥基多巴胺注射的一側(cè))。幾周后研究者發(fā)現(xiàn),10只受移植的小鼠中有9只的運(yùn)動(dòng)功能得到顯著改善，其中甚至有1只小鼠受

20、損側(cè)的運(yùn)動(dòng)功能好于未受損側(cè)。,Ips細(xì)胞研究中存在的問(wèn)題,1、腫瘤相關(guān)基因，如c-myc的使用，有誘發(fā)癌癥的可能2、逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染可能會(huì)導(dǎo)致一些癌基因的激活，也可能導(dǎo)致某些重要基因功能受阻。3、基因表達(dá)模式與ESC還存在一些不同。4、效率較低，重組率只有0.1%。,總結(jié),,組內(nèi)同學(xué)的分工,細(xì)胞重編程概況部分：演講（陳宇翰），資料（林曉鋒），圖片（梁樂(lè)）體細(xì)胞重編程逆轉(zhuǎn)為干細(xì)胞以及誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞誘導(dǎo)機(jī)制部分：演講（劉曉暉），資料