第四章、細(xì)菌遺傳學(xué)i

1、第四章、細(xì)菌遺傳學(xué)I,內(nèi)容,介紹當(dāng)前對質(zhì)粒分配和拷貝數(shù)控制的調(diào)控機(jī)制的研究，（參考教材101頁）,學(xué)習(xí)要求,認(rèn)識質(zhì)粒分配與不相容性,質(zhì)粒分配與不相容性,質(zhì)粒,質(zhì)粒是能獨立于寄主染色體而自主復(fù)制并被穩(wěn)定遺傳的一類核酸分子絕大多數(shù)的質(zhì)粒是DNA型 目前已知只有酵母殺傷質(zhì)粒(killer plasmid)是RNA型絕大多數(shù)的天然DNA質(zhì)粒為共價、閉合、環(huán)狀的分子結(jié)構(gòu)，即cccDNA (covalently close circu

2、lar DNA )質(zhì)粒DNA的分子量范圍：1 - 200 kb,知識點回顧,已學(xué)知識點回顧,一、質(zhì)粒分配與不相容性,混合配對模型,Random positioning of incompatible plasmids.,A. Sibling plasmids are initially paired, segregated and positioned along the cell. As fresh replicas are gen

3、erated during the cell cycle, the positioning mechanism continues to be activated and to reposition plasmids two at a time, leading to asymmetric plasmid distribution and often to the absence of a plasmid from one cell-h

4、alf.,B. A large partition complex is more likely than a smaller one to activate and stabilize the positioning process. The plasmid with the larger centromere (circle) is thus more likely than that with the smaller one (o

5、void) to be chosen for positioning and to be placed at the centres of the cell-halves; plasmids with smaller centromeres are more likely to wander and be lost. Note that repositioning will tend to moderate a preference f

6、or positioning plasmids with largecentromeres/partition complexes.,Indirect pairing. Partition does not necessarily start by breaking the ParB–ParB interactions responsible for pairing partition complexes on sibling pla

7、smids. Instead, ParA can be activated by a ParB–DNA entity that consists of either an isolated ParB–parS complex, a paired complex (as shown) or an ensemble in a plasmid cluster. Partition ensues when the activated ParA

8、encounters another ParB–DNA entity, which may never have been in contact with the activating one. Thus, plasmids can be segregated as either clusters, pairs or individuals.,問題：細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒是平均分配的么？,,ParB不直接相互作用的質(zhì)粒間也可發(fā)生分配,二、 質(zhì)粒復(fù)

9、制（拷貝數(shù)）與不相容性,質(zhì)粒能利用寄主細(xì)胞的DNA復(fù)制系統(tǒng)進(jìn)行自主復(fù)制,并賦宿主細(xì)胞特定的遺傳性狀.質(zhì)粒DNA的復(fù)制方式: 主要有“θ”型復(fù)制和滾環(huán)復(fù)制根據(jù)在每個細(xì)胞中拷貝數(shù)的多寡，質(zhì)?？煞譃閮纱髲?fù)制類型： ① 嚴(yán)緊型質(zhì)粒(Stringent plasmid) ② 松弛型質(zhì)粒(Relaxed plasmid) 一種質(zhì)粒究竟是屬于嚴(yán)緊型還是松弛型并不是絕對的，同一質(zhì)粒在不同的宿主細(xì)胞中可能

10、具有不同的復(fù)制型，這說明質(zhì)粒的復(fù)制不僅受自身的制約，同時還受到宿主的控制，同宿主的狀況有關(guān)。,（一）、質(zhì)粒復(fù)制的調(diào)控,為與宿主穩(wěn)定地共存并把代謝負(fù)擔(dān)減至最低, 質(zhì)粒必須控制自身的復(fù)制。在一定的生長條件下、在一定的宿主菌中, 某一質(zhì)粒的拷貝數(shù)(N) 通常是一定的。負(fù)調(diào)控模型 質(zhì)粒剛移入新宿主時,負(fù)調(diào)節(jié)因子的濃度可忽略不計, 質(zhì)粒能在短時間內(nèi)達(dá)到正?？截悢?shù), 然后通過增加或減少每細(xì)胞周期每質(zhì)粒拷貝的復(fù)制率來調(diào)節(jié)細(xì)胞

11、中的質(zhì)粒拷貝數(shù)(N), 使該菌群中各細(xì)胞的質(zhì)?？截悢?shù)維持在平均值(Nav )附近的一個很小的波動范圍內(nèi)。 上述控制機(jī)制是由質(zhì)粒自編碼的負(fù)控制系統(tǒng)通過調(diào)控復(fù)制起始率而實現(xiàn)的, 其負(fù)控制元件就編碼在質(zhì)粒上依所用負(fù)控制元件的類型不同, 質(zhì)粒復(fù)制的控制系統(tǒng)主要有: 重復(fù)子控制和反義RNA控制,復(fù)制起始蛋白Rep 蛋白能以二體形式結(jié)合于啟動子區(qū), 反式作用, 對其合成進(jìn)行自我調(diào)節(jié);Rep 蛋白對復(fù)制具有雙向調(diào)控作用, 且視它的

12、胞內(nèi)濃度而定, 當(dāng)胞內(nèi)濃度低時起復(fù)制激活劑作用, 胞內(nèi)濃度高時則起抑制劑作用?！笆咒D”模型( “handcuffing”model),1、重復(fù)子控制,空間位阻模型,空間位阻模型認(rèn)為, 決定質(zhì)粒復(fù)制率的主要因素是重復(fù)子的濃度而不是Rep 蛋白的表達(dá)水平。當(dāng)質(zhì)?？截悢?shù)較低時, Rep蛋白與重復(fù)子結(jié)合并飽和, 促發(fā)復(fù)制起始; 隨著質(zhì)?？截悢?shù)的增加, 結(jié)合于某一起點重復(fù)子的Rep 分子, 開始與結(jié)合于另一起點重復(fù)子的Rep 分子相互作用, 并

13、通過Rep- Rep 相互作用把2個環(huán)狀質(zhì)粒分子偶聯(lián)起來, 形成“手銬”狀的復(fù)合物, 導(dǎo)致這2個重復(fù)子區(qū)域之間出現(xiàn)空間位阻而阻斷復(fù)制的起始。在隨后的細(xì)胞生長期間, 這種質(zhì)粒對也逐漸分離, 使各質(zhì)粒分子的復(fù)制起始潛力得以恢復(fù)。,⒉ 反義RNA控制,在這一模式中,由質(zhì)粒編碼的抑制因子(反義RNA)結(jié)合在復(fù)制起始區(qū)的特定靶位點上,對復(fù)制起負(fù)調(diào)控作用。反義RNA : 小RNA 分子, 長35～150 nt, 有1～4個莖-環(huán)( ste

14、m-loop) , 其序列與靶轉(zhuǎn)錄物 5' 端的一個區(qū)域互補(bǔ), 又稱反轉(zhuǎn)錄RNA( countertranscribed RNA, ctRNA)反義RNA的作用方式主要有以下兩種: ⑴ 抑制引物RNA 加工 (以ColE1質(zhì)粒為例來說明) ⑵ 抑制前導(dǎo)肽翻譯 (以R1質(zhì)粒為例來說明),⑴抑制引物RNA 加工,ColE1 質(zhì)粒的復(fù)制起始由一長為700 nt 的轉(zhuǎn)錄物RNAⅡ(prep

15、rimer)引發(fā)。RNAⅡ由宿主RNA 聚合酶合成, 經(jīng)構(gòu)象變化后, 與模板DNA在復(fù)制起始區(qū)附近偶聯(lián)(coupling)形成RNAⅡ-DNA雜交物, RNase H切割其中的RNA 部分, 產(chǎn)生游離的3‘ - OH, 再在DNA 聚合酶Ⅰ的作用下, 從這個游離的3’ - OH開始DNA前導(dǎo)鏈的合成。3‘ - OH的生成是復(fù)制起始的限速步驟, 受反義RNA(RNAⅠ)調(diào)控。RNAⅠ序列與RNAⅡ的前108 堿基序列完全互補(bǔ), 互補(bǔ)區(qū)結(jié)

16、合可改變RNAⅡ下游效應(yīng)位點的二級結(jié)構(gòu), 使RNAⅡ的3’ 端不能與模板DNA偶聯(lián),RNase H 就不能對RNAⅡ進(jìn)行加工, 從而阻斷引物的生成, 抑制復(fù)制的起始。,,控制復(fù)制引物與模板的結(jié)合RNAⅠ的啟動子是組成型的, 故其數(shù)量與質(zhì)?？截悢?shù)成正比, 但不穩(wěn)定。在ColE1 中還有一個質(zhì)粒編碼的控制元件Rom 蛋白(又稱Rop 蛋白) , Rop蛋白是RNA 結(jié)合蛋白, 它能增強(qiáng)RNAⅠ與RNAⅡ的相互作用, 穩(wěn)定RNAⅠ- RN

17、AⅡ復(fù)合物, 因而能加強(qiáng)對復(fù)制的抑制作用, 但在上述控制回路中只起輔助作用。,除RNA1以外還有Rop 蛋白強(qiáng)化這種抑制,⑵ 抑制前導(dǎo)肽翻譯,這種作用方式的例子是質(zhì)粒R1（兩種方式）, 它的基本復(fù)制子含有可讀框copB、tap 和repA, 分別編碼轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白CopB、前導(dǎo)肽TAP和起始必需蛋白RepA。tap 和repA 是翻譯偶聯(lián)的。RepA蛋白是復(fù)制的限速因子, 以順式作用, 但不能重復(fù)使用, 其復(fù)制控制在轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個水平上

18、進(jìn)行。主控制元件是RNAⅠ,從repA-mRNA 前導(dǎo)區(qū)的一段互補(bǔ)鏈轉(zhuǎn)錄而來, 長約90 nt。質(zhì)粒拷貝數(shù)(基因劑量)與RNAⅠ水平呈正相關(guān),CopB可以二聚體形式阻遏repA始自PrepA啟動子(位于copB下游)的轉(zhuǎn)錄。在穩(wěn)態(tài)條件下，CopB呈飽和濃度，可充分阻遏repA始自PrepA的轉(zhuǎn)錄，使其維持在基線水平。此時，repA mRNA 主要以copB-tap-repA RNA 多順反子形式合成。但在質(zhì)粒定居的早期階段，質(zhì)?？截悢?shù)

19、很低，CopB介導(dǎo)的阻遏失效。此時， PrepA啟動子去阻遏，repA 轉(zhuǎn)錄為tap-repA mRNA，,質(zhì)粒不相容性的原因 質(zhì)粒的不相容性現(xiàn)象主要是與質(zhì)粒的復(fù)制調(diào)控和分離(segregation)機(jī)制有關(guān)，不能在同一細(xì)胞中并存的質(zhì)粒是因為他們共享一個或多個共同的復(fù)制因子或相同的分配系統(tǒng)。(對于單拷貝質(zhì)粒???)當(dāng)兩種復(fù)制及調(diào)控機(jī)制毫不相干的質(zhì)粒在同一個細(xì)胞中生存時,它們各自復(fù)制,再各自分配到不同的子細(xì)胞中,不

20、會發(fā)生干擾。當(dāng)兩種復(fù)制及調(diào)控機(jī)制相關(guān)或相同的質(zhì)粒在同一個細(xì)胞中生存時,質(zhì)粒復(fù)制及調(diào)控機(jī)制就會把它們看做成同種質(zhì)粒而將他們的拷貝數(shù)控制在一定的數(shù)目內(nèi)。由于細(xì)胞時質(zhì)粒在子細(xì)胞中分配不均勻的緣故,經(jīng)過幾十次的細(xì)胞分裂后,就會造成敏感質(zhì)粒的分離丟失。,2、 質(zhì)粒不相容性,不相容性的分子生物學(xué)基礎(chǔ)是質(zhì)粒的復(fù)制調(diào)控機(jī)制存在同源性,此外具有相同復(fù)制起始位點和分配區(qū)的兩種質(zhì)粒也不能共存于同一個宿主菌 影響不相容性的主要因素: ⑴質(zhì)粒分離機(jī)