第三篇臨床真菌學(xué)

1、真菌學(xué)概論,真菌（fungus）為真核細(xì)胞型微生物，屬于真菌界（Kingdom of Myceteae）。具有典型的細(xì)胞核，不含葉綠素，以腐生或寄生方式攝取營(yíng)養(yǎng)，細(xì)胞壁含幾丁質(zhì)（Chitin）和（或）纖維素，有完善細(xì)胞器，能進(jìn)行有性生殖和（或）無(wú)性繁殖。多數(shù)對(duì)人有益，僅少數(shù)導(dǎo)致人類疾病。,,真菌細(xì)胞結(jié)構(gòu),真菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)較原核細(xì)胞更為復(fù)雜，有完整的細(xì)胞核結(jié)構(gòu)（包括核膜、核質(zhì)和核仁）和一套具有特定功能的細(xì)胞器（包括線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體

2、，真菌細(xì)胞壁含有甲殼質(zhì)（chitin）和β-葡聚糖，細(xì)胞膜含有固醇，營(yíng)養(yǎng)方式為吸收，無(wú)吞噬作用，營(yíng)腐生、寄生、共生和超寄生生活。,原核細(xì)胞型與真核細(xì)胞型微生物的結(jié)構(gòu)比較,單細(xì)胞真菌 (monocellular fungus) ：圓形或卵圓形，有芽生孢子，形成酵母型菌落，如酵母菌(yeast) 、新生隱球菌二相真菌 (dimorphic fungus)：又稱酵母樣真菌(yeast-like fungi)，有芽生孢子和假菌絲，形成類酵母型

3、菌落，如白假絲酵母菌、組織胞漿菌、馬爾尼菲青霉菌多細(xì)胞真菌 (multicellular fungus) ：又稱絲狀真菌(filamentous fungus)或霉菌(mold)，由菌絲hypha和孢子spore組成，形成絲狀菌落，如絮狀表皮癬菌、曲霉菌,,分類：形態(tài)與結(jié)構(gòu),單細(xì)胞真菌形態(tài)圓形或卵圓形，產(chǎn)芽生孢子,,新生隱球菌,酵母菌出芽繁殖,多細(xì)胞真菌形態(tài),多細(xì)胞真菌由菌絲hypha和孢子spore組成，其形態(tài)多樣，是真菌鑒定的重

4、要依據(jù),在環(huán)境適宜情況下由孢子長(zhǎng)出芽管，逐漸延長(zhǎng)呈絲狀，稱菌絲，分為：,菌絲形態(tài)有助于鑒別,菌絲 hypha,為真菌的繁殖結(jié)構(gòu)，在環(huán)境適宜情況下分裂，可分化為菌絲等結(jié)構(gòu)，根據(jù)產(chǎn)生方式分為：有性孢子: 同一菌體或不同菌體上的2個(gè)細(xì)胞融合經(jīng) 減數(shù)分裂形成無(wú)性孢子：菌絲上的細(xì)胞分化或出芽生成，不經(jīng)兩性細(xì)胞的配合。病原性真菌大多形成無(wú)性孢子，分為：,,,,,,,分生孢子,葉狀孢子,孢子囊孢子,大分生孢子 大小、細(xì)胞數(shù)和顏色是鑒

5、 定的重要依據(jù)小分生孢子 真菌都能產(chǎn)生,,芽生孢子 假菌絲厚膜孢子關(guān)節(jié)孢子,,孢子 spore,生殖菌絲末端細(xì)胞分裂或收縮形成；也可從菌絲側(cè)面出芽形成,大分生孢子的形態(tài),,芽生孢子,,厚膜孢子,,關(guān)節(jié)孢子,,,孢子囊孢子,二相型真菌,二相型真菌,白色念珠菌呈圓形或卵圓形，直徑3~6μm。革蘭陽(yáng)性，出芽方式繁殖，在沙氏培養(yǎng)基或組織內(nèi)可見(jiàn)芽生孢子、假菌絲,莢膜組織胞漿菌 體外培養(yǎng)菌落為棉絮狀，鏡檢可見(jiàn)細(xì)長(zhǎng)有隔菌絲

6、和圓形大分生孢子，血液標(biāo)本中可見(jiàn)中性粒細(xì)胞或單核細(xì)胞漿中有卵圓形或圓形的酵母細(xì)胞,真菌的生長(zhǎng)特性,生長(zhǎng)條件：營(yíng)養(yǎng)要求不高，常用沙保弱培養(yǎng)基（含葡萄糖、蛋白胨和瓊脂），最適pH4.0~6.0，22~28℃（深部真菌37℃）， 較高的濕度和O2，可形成3種類型菌落：酵母型菌落：由單細(xì)胞真菌形式，濕潤(rùn)、柔軟而致密，形態(tài)似一般細(xì)菌菌落類酵母型菌落：由二相真菌形式，形態(tài)似酵母型菌落，有假菌絲絲狀菌落：多細(xì)胞真菌形式，有棉絮狀、絨毛狀、粉末狀

7、（氣生菌絲體），菌落正面與背面、中心與邊緣呈不同顏色，為重要鑒定依據(jù)。玻片小培養(yǎng)鏡下可見(jiàn)孢子、菌絲及完整菌絲體,,酵母菌形成的酵母型菌落,白假絲酵母菌形成的類酵母型菌落,真菌菌落,曲霉屬,多細(xì)胞真菌形成的絲狀菌落：表面有棉絮狀、絨毛狀、粉末狀，有皺紋，菌落正面與背面、中心與邊緣呈不同顏色，為重要鑒定依據(jù)。,青霉菌落,抵抗力,對(duì)干燥、日光、紫外線及一般消毒劑抵抗力強(qiáng)對(duì)熱敏感，60℃1小時(shí)菌絲、孢子均被殺死對(duì)2%石碳酸、0.1%升汞、2

8、.5%碘酊或10%甲醛敏感對(duì)細(xì)菌抗生素不敏感對(duì)二性霉素B、制霉菌素、咪康唑、酮康唑、氟康唑和伊曲康唑敏感,致病性真菌感染： 外源性真菌感染，如 皮膚癬真菌病條件致病性真菌?。簝?nèi)源性真菌感染, 機(jī)體免疫力低下，如白假絲酵母菌、曲霉、毛霉等引起真菌超敏反應(yīng)性疾?。好舾谢颊呶腈咦踊蚓z等, 引起超敏反應(yīng)，如尋痲疹、哮喘、變應(yīng)性鼻炎真菌毒素中毒：糧食受潮霉變，攝入真菌或其產(chǎn)生的毒素后可引起急、慢性中毒稱為真菌中毒癥（mycotox

9、icosis) 。主要有：黃曲霉毒素和鐮刀菌毒素真菌毒素誘發(fā)腫瘤: 黃曲霉毒素-原發(fā)性肝癌、鐮刀菌T-2毒素、 展青霉素 、黃褐毒素,真菌的致病性,免疫性,,天然免疫：免疫力與機(jī)體免疫狀態(tài)有關(guān) 皮膚粘膜屏障作用 正常菌群的拮抗作用 吞噬細(xì)胞的作用,獲得性免疫：真菌感染的治愈與細(xì)胞免疫有關(guān) 真菌感染可引發(fā)遲發(fā)性超敏反應(yīng)------癬菌疹,真菌分類,我國(guó)普遍采用的是Ainsworth等分類法，與

10、醫(yī)學(xué)有關(guān)的真菌為真菌門中的四個(gè)亞門:接合亞門（zygomycotina）子囊菌亞門（Ascomycotina）擔(dān)子菌亞門（Basidiomycotina）半知菌亞門（Deutermycotina）,致病性真菌類屬,,真菌的微生物學(xué)檢查法,,,真菌標(biāo)本的種類,皮膚的角質(zhì)性物質(zhì)：毛發(fā)、指（趾）甲、皮屑等。各種分泌物和排泄物：生殖道分泌物、耳垢、痰、糞便、尿液等。血液和體液：體液包括胸水、腹水、腦脊液、淋巴穿刺液等。膿汁及滲出物

11、。,真菌標(biāo)本采集原則,采集的標(biāo)本要適宜：不同真菌感染應(yīng)采取不同的臨床標(biāo) 本。懷疑為淺部真菌感染如體癬，應(yīng)刮取病變邊緣的痂、皮屑，發(fā)癬應(yīng)取折斷了的病發(fā)。懷疑為深部真菌感染應(yīng)取血液、腦脊液、痰、膿汁等。在用藥前采集標(biāo)本：一般真菌標(biāo)本須在用藥前采集，對(duì)已用藥者則需停藥一段時(shí)間后再采集標(biāo)本。采集足量標(biāo)本：血液和腦脊液標(biāo)本5ml，胸腔液20ml，皮屑標(biāo)本兩塊，活體組織兩份（一份送病理科檢查，一份作鏡檢和培養(yǎng)）。嚴(yán)格無(wú)菌操作：在采集標(biāo)本時(shí)嚴(yán)格

12、無(wú)菌操作，并進(jìn)行消毒處理，尤其是在采集血液和腦脊液標(biāo)本時(shí)，要避免污染雜菌。采集后立即送檢：對(duì)采集的標(biāo)本應(yīng)立即送檢，特別是深部真菌標(biāo)本采集后最長(zhǎng)不超過(guò)2h。,真菌的檢驗(yàn)方法,真菌形態(tài)學(xué)檢查真菌抗原檢測(cè)真菌分離培養(yǎng)與鑒定真菌核酸檢測(cè)真菌毒素檢測(cè),真菌形態(tài)學(xué)檢查,直接鏡檢：方法簡(jiǎn)便，快速,,10%KOH,微加熱,低倍/高倍鏡檢查菌絲/孢子,角質(zhì)標(biāo)本（皮膚癬菌）,染色后觀察 假絲酵母菌--取材涂片，革蘭染色 隱球菌--

13、腦脊液離心取沉淀涂片，墨汁負(fù)染,,腦脊液涂片-新生隱球菌,表皮癬菌,真菌的直接涂片檢查,常用的染色方法,常用的染色方法有革蘭染色、瑞氏染色、熒光染色，乳酸酚棉藍(lán)染色、還有墨汁負(fù)染色等。對(duì)檢測(cè)骨髓和外周血中的莢膜組織胞漿菌，需作瑞氏染色或姬氏染色后鏡檢。檢測(cè)病人腦脊液標(biāo)本中新生隱球菌，需作墨汁負(fù)染色后檢查，背景為黑色，新生隱球菌和莢膜不著色,直接鏡檢意義,結(jié)果判斷：組織中分隔分枝的菌絲為曲霉; 粗大、不分隔或不分枝的菌絲為毛霉。皮膚癬

14、菌菌絲肥大粗長(zhǎng)為處于活躍狀態(tài)。酵母型和二相型真菌在組織內(nèi)常為孢子。陽(yáng)性結(jié)果有診斷意義，如淺部真菌病、隱球菌病、皮膚粘膜假絲酵母菌病等代表組織相，直接鏡檢看到的真菌形態(tài)就是該真菌的組織形態(tài)，如假絲酵母的菌絲、淺部真菌的厚膜孢子等；確定某些致病性真菌屬或種，如皮膚癬菌、曲霉等判斷某些真菌種的致病性等,直接鏡檢的局限性,陰性結(jié)果不能排除真菌感染，直接鏡檢不如培養(yǎng)敏感，其敏感性隨標(biāo)本類型、數(shù)量、采集時(shí)間和質(zhì)量等而有所不同 有假陽(yáng)性結(jié)果，

15、如溶解的淋巴細(xì)胞在腦脊液印度墨汁濕片中易誤認(rèn)為新生隱球菌；脂肪微滴也可與出芽酵母細(xì)胞混淆,抗原檢測(cè),采用免疫學(xué)方法檢測(cè)真菌抗原，常用的方法有膠乳凝集試驗(yàn)、ELISA、半定量放射免疫測(cè)定法。,真菌的分離培養(yǎng),真菌培養(yǎng)是目前鑒定真菌的唯一方法。培養(yǎng)成功與否與采集的標(biāo)本是否適當(dāng)、是否新鮮、培養(yǎng)基的選擇、培養(yǎng)溫度與時(shí)間等有關(guān)。大多數(shù)真菌培養(yǎng)的溫度為28℃，但深部真菌為37℃。對(duì)二相性真菌培養(yǎng)時(shí), 28℃培養(yǎng)真菌呈菌絲相（霉菌型），37℃培養(yǎng)

16、為組織相（酵母型）。平皿培養(yǎng): 表面較大可使標(biāo)本散布，便于觀察菌落形態(tài)，但水分易蒸發(fā)，只能培養(yǎng)生長(zhǎng)繁殖較快的真菌，如假絲酵母菌、隱球菌。 大試管培養(yǎng): 水分不易蒸發(fā)，主要用于皮膚癬菌的培養(yǎng)和真菌菌種的保存。玻片培養(yǎng)(微量培養(yǎng)、小培養(yǎng)): 可用于真菌菌種的鑒定。,觀察菌落形態(tài)時(shí)注意,菌落性質(zhì)，是酵母菌還是霉菌。菌落大小,一般病原性真菌菌落小，而條件致病性真菌菌落大。菌落顏色，一般病原性真菌顏色淡，污染真菌顏色深。致病性真菌菌落

17、下沉，污染性真菌菌落不下沉; 致病性真菌有時(shí)使培養(yǎng)基開(kāi)裂，但污染霉菌很少引起培養(yǎng)基開(kāi)裂。,真 菌 鑒 定,菌落觀察形態(tài)學(xué)觀察生化反應(yīng)：糖(醇)類發(fā)酵試驗(yàn)、同化碳源試驗(yàn)、同化氮源試驗(yàn)、硝酸鉀試驗(yàn)利用、牛乳分解試驗(yàn)、酚氧化酶試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)和脲酶試驗(yàn)等。主要用于檢驗(yàn)深部感染真菌如假絲酵母菌、隱球菌等。分子生物學(xué)鑒定,動(dòng)物試驗(yàn): 分離病原性真菌、確定真菌菌種的致病性、研究藥物對(duì)真菌的作用等。 核酸檢測(cè): 操作簡(jiǎn)便、省時(shí)省工、敏感性和

18、特異性高的優(yōu)點(diǎn)，但要一定的實(shí)驗(yàn)條件，并大多仍處于實(shí)驗(yàn)研究階段，故目前不可能完全替代常規(guī)鑒定方法 。真菌毒素的檢測(cè): 生物學(xué)方法、薄層層析法、高效液相色譜法和間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法等。,真菌非培養(yǎng)檢測(cè)技術(shù),多烯類抗生素，如兩性霉素B、制霉菌素、曲古霉素等。吡咯類，包括酮康唑、伊曲康唑、氟康唑、伏立康唑、克霉唑、益康唑等。其他類如氟胞嘧啶。,抗真菌藥物分類--化學(xué)結(jié)構(gòu)分類,抗真菌藥物分類--化學(xué)結(jié)構(gòu)分類,作用于真菌細(xì)胞膜：兩性霉素B、制

19、霉菌素、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、酮康唑及克霉唑等。作用于真菌細(xì)胞壁：尼可霉素Z、卡泊芬凈及普拉米星（pradimicin）等。作用于真菌核酸：干擾真菌DNA合成，5－氟尿嘧啶（5－FC）等。其他：大蒜新素（allitridum）及冰醋酸（glaciale acetic acid）等。,抗真菌藥物分類--作用機(jī)理分類,兩性霉素B：兩性霉素對(duì)大多數(shù)深部致病真菌具有活性，如念珠菌、新型隱球菌、曲菌、組織胞漿菌、雙向真菌等均有較強(qiáng)的抑

20、制作用。但對(duì)皮膚和毛發(fā)癬菌大多耐藥。酮康唑(ketoconazole) 對(duì)念珠菌、著色真菌 屬、球孢子菌屬等有抗菌活性，對(duì)毛發(fā)癬菌亦具抗菌活性。氟康唑(fluconazole) ：對(duì)念珠菌、隱球菌 具有較高抗菌活性。氟胞嘧啶：為窄譜抗生素，對(duì)念珠菌、新型隱球菌和球擬酵母有較高抗菌活性，對(duì)其他真菌抗菌作用差，易產(chǎn)生耐藥性，故常和兩性霉素B聯(lián)合使用。,臨床常用抗真菌藥物,抗真菌藥物藥敏試驗(yàn)原則,提供兩種以上有相當(dāng)活性的抗真菌藥

21、物的可信測(cè)量方法和體內(nèi)的活性具有相關(guān)性，可預(yù)測(cè)治療的效果可用來(lái)監(jiān)控敏感群體菌株的耐藥性發(fā)生可預(yù)期研究新藥的潛在治療效能。,真菌藥物敏感試驗(yàn)過(guò)程,方法:肉湯稀釋法，包括常量稀釋法和微量稀釋法。 培養(yǎng)基:含谷氨酰胺和pH指示劑，不含碳酸氫鈉RPMI 1640培養(yǎng)基。程序:藥物原液配制 接種菌液制備 藥液稀釋 常量稀法 微量稀釋法 結(jié)果判斷 質(zhì)量控制,,,,,,取　材　

22、 接種動(dòng)物　 接種途徑　 潛伏期 動(dòng)物病變白假絲　　 痰、尿　　　 家兔、　　　耳靜脈、 3~5d　　腎臟明顯腫脹，腎　　　　酵母菌病　 便、血　　　 小白兔　　　腹腔　　　　 　皮質(zhì)部位有白色膿瘍　　新生隱球　 腦脊液、　　 小白鼠　　　顱內(nèi)、 2~8周　 死亡。取標(biāo)本涂片、　　菌病　　　 膿、痰、尿 　　　　　　 腹腔　　　　

23、 墨汁負(fù)染色見(jiàn)帶莢膜　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　孢子絲　　 膿汁、痰液　 大、小　　　腹腔、 1~3周　 腸系膜、腹膜有肉芽菌病　　　 活體組織、　小白鼠　　　睪丸組織 形成，睪丸腫大　（涂

24、 片見(jiàn)G+圓形、卵圓形 “雪茄煙“狀小體） 　　　著色真　　膿汁、培養(yǎng)物　 大白鼠　　 腹腔、　　　　　　 肺、腎、腹腔呈肉芽　　　菌病　　　　、活體

25、組織　 小白鼠　　 睪丸、靜脈　數(shù)周　　 腫損害　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　組織胞　　　血、骨髓、　大白鼠　　 腹腔、　　　　　　 死亡、肝、脾、腎淋　　　漿菌病　　　痰、皮膚　　小白鼠　　 顱內(nèi)　　 1~2周　 巴結(jié)呈肉芽腫損害。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 涂片，于巨噬細(xì)胞和　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　大單核細(xì)胞內(nèi)可查到本菌　

26、　球孢子　　 血液、骨髓、　小白鼠、　腹腔、　 1~2周　 死亡?？蓮母?、脾、肺等　　　　　菌病　　　痰、皮膚　　　 豚鼠　　　 睪丸　　　　　　器官及腹膜找到本菌。睪 丸膿腫可見(jiàn)典型的球菌,常見(jiàn)深部真菌病動(dòng)物試驗(yàn)鑒別