第三篇臨床真菌學

1、真菌學概論,真菌（fungus）為真核細胞型微生物，屬于真菌界（Kingdom of Myceteae）。具有典型的細胞核，不含葉綠素，以腐生或寄生方式攝取營養(yǎng)，細胞壁含幾丁質(zhì)（Chitin）和（或）纖維素，有完善細胞器，能進行有性生殖和（或）無性繁殖。多數(shù)對人有益，僅少數(shù)導致人類疾病。,,真菌細胞結(jié)構(gòu),真菌細胞結(jié)構(gòu)較原核細胞更為復雜，有完整的細胞核結(jié)構(gòu)（包括核膜、核質(zhì)和核仁）和一套具有特定功能的細胞器（包括線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體

2、，真菌細胞壁含有甲殼質(zhì)（chitin）和β-葡聚糖，細胞膜含有固醇，營養(yǎng)方式為吸收，無吞噬作用，營腐生、寄生、共生和超寄生生活。,原核細胞型與真核細胞型微生物的結(jié)構(gòu)比較,單細胞真菌 (monocellular fungus) ：圓形或卵圓形，有芽生孢子，形成酵母型菌落，如酵母菌(yeast) 、新生隱球菌二相真菌 (dimorphic fungus)：又稱酵母樣真菌(yeast-like fungi)，有芽生孢子和假菌絲，形成類酵母型

3、菌落，如白假絲酵母菌、組織胞漿菌、馬爾尼菲青霉菌多細胞真菌 (multicellular fungus) ：又稱絲狀真菌(filamentous fungus)或霉菌(mold)，由菌絲hypha和孢子spore組成，形成絲狀菌落，如絮狀表皮癬菌、曲霉菌,,分類：形態(tài)與結(jié)構(gòu),單細胞真菌形態(tài)圓形或卵圓形，產(chǎn)芽生孢子,,新生隱球菌,酵母菌出芽繁殖,多細胞真菌形態(tài),多細胞真菌由菌絲hypha和孢子spore組成，其形態(tài)多樣，是真菌鑒定的重

4、要依據(jù),在環(huán)境適宜情況下由孢子長出芽管，逐漸延長呈絲狀，稱菌絲，分為：,菌絲形態(tài)有助于鑒別,菌絲 hypha,為真菌的繁殖結(jié)構(gòu)，在環(huán)境適宜情況下分裂，可分化為菌絲等結(jié)構(gòu)，根據(jù)產(chǎn)生方式分為：有性孢子: 同一菌體或不同菌體上的2個細胞融合經(jīng) 減數(shù)分裂形成無性孢子：菌絲上的細胞分化或出芽生成，不經(jīng)兩性細胞的配合。病原性真菌大多形成無性孢子，分為：,,,,,,,分生孢子,葉狀孢子,孢子囊孢子,大分生孢子 大小、細胞數(shù)和顏色是鑒

5、 定的重要依據(jù)小分生孢子 真菌都能產(chǎn)生,,芽生孢子 假菌絲厚膜孢子關(guān)節(jié)孢子,,孢子 spore,生殖菌絲末端細胞分裂或收縮形成；也可從菌絲側(cè)面出芽形成,大分生孢子的形態(tài),,芽生孢子,,厚膜孢子,,關(guān)節(jié)孢子,,,孢子囊孢子,二相型真菌,二相型真菌,白色念珠菌呈圓形或卵圓形，直徑3~6μm。革蘭陽性，出芽方式繁殖，在沙氏培養(yǎng)基或組織內(nèi)可見芽生孢子、假菌絲,莢膜組織胞漿菌 體外培養(yǎng)菌落為棉絮狀，鏡檢可見細長有隔菌絲

6、和圓形大分生孢子，血液標本中可見中性粒細胞或單核細胞漿中有卵圓形或圓形的酵母細胞,真菌的生長特性,生長條件：營養(yǎng)要求不高，常用沙保弱培養(yǎng)基（含葡萄糖、蛋白胨和瓊脂），最適pH4.0~6.0，22~28℃（深部真菌37℃）， 較高的濕度和O2，可形成3種類型菌落：酵母型菌落：由單細胞真菌形式，濕潤、柔軟而致密，形態(tài)似一般細菌菌落類酵母型菌落：由二相真菌形式，形態(tài)似酵母型菌落，有假菌絲絲狀菌落：多細胞真菌形式，有棉絮狀、絨毛狀、粉末狀

7、（氣生菌絲體），菌落正面與背面、中心與邊緣呈不同顏色，為重要鑒定依據(jù)。玻片小培養(yǎng)鏡下可見孢子、菌絲及完整菌絲體,,酵母菌形成的酵母型菌落,白假絲酵母菌形成的類酵母型菌落,真菌菌落,曲霉屬,多細胞真菌形成的絲狀菌落：表面有棉絮狀、絨毛狀、粉末狀，有皺紋，菌落正面與背面、中心與邊緣呈不同顏色，為重要鑒定依據(jù)。,青霉菌落,抵抗力,對干燥、日光、紫外線及一般消毒劑抵抗力強對熱敏感，60℃1小時菌絲、孢子均被殺死對2%石碳酸、0.1%升汞、2

8、.5%碘酊或10%甲醛敏感對細菌抗生素不敏感對二性霉素B、制霉菌素、咪康唑、酮康唑、氟康唑和伊曲康唑敏感,致病性真菌感染： 外源性真菌感染，如 皮膚癬真菌病條件致病性真菌?。簝?nèi)源性真菌感染, 機體免疫力低下，如白假絲酵母菌、曲霉、毛霉等引起真菌超敏反應性疾?。好舾谢颊呶腈咦踊蚓z等, 引起超敏反應，如尋痲疹、哮喘、變應性鼻炎真菌毒素中毒：糧食受潮霉變，攝入真菌或其產(chǎn)生的毒素后可引起急、慢性中毒稱為真菌中毒癥（mycotox

9、icosis) 。主要有：黃曲霉毒素和鐮刀菌毒素真菌毒素誘發(fā)腫瘤: 黃曲霉毒素-原發(fā)性肝癌、鐮刀菌T-2毒素、 展青霉素 、黃褐毒素,真菌的致病性,免疫性,,天然免疫：免疫力與機體免疫狀態(tài)有關(guān) 皮膚粘膜屏障作用 正常菌群的拮抗作用 吞噬細胞的作用,獲得性免疫：真菌感染的治愈與細胞免疫有關(guān) 真菌感染可引發(fā)遲發(fā)性超敏反應------癬菌疹,真菌分類,我國普遍采用的是Ainsworth等分類法，與

10、醫(yī)學有關(guān)的真菌為真菌門中的四個亞門:接合亞門（zygomycotina）子囊菌亞門（Ascomycotina）擔子菌亞門（Basidiomycotina）半知菌亞門（Deutermycotina）,致病性真菌類屬,,真菌的微生物學檢查法,,,真菌標本的種類,皮膚的角質(zhì)性物質(zhì)：毛發(fā)、指（趾）甲、皮屑等。各種分泌物和排泄物：生殖道分泌物、耳垢、痰、糞便、尿液等。血液和體液：體液包括胸水、腹水、腦脊液、淋巴穿刺液等。膿汁及滲出物

11、。,真菌標本采集原則,采集的標本要適宜：不同真菌感染應采取不同的臨床標 本。懷疑為淺部真菌感染如體癬，應刮取病變邊緣的痂、皮屑，發(fā)癬應取折斷了的病發(fā)。懷疑為深部真菌感染應取血液、腦脊液、痰、膿汁等。在用藥前采集標本：一般真菌標本須在用藥前采集，對已用藥者則需停藥一段時間后再采集標本。采集足量標本：血液和腦脊液標本5ml，胸腔液20ml，皮屑標本兩塊，活體組織兩份（一份送病理科檢查，一份作鏡檢和培養(yǎng)）。嚴格無菌操作：在采集標本時嚴格

12、無菌操作，并進行消毒處理，尤其是在采集血液和腦脊液標本時，要避免污染雜菌。采集后立即送檢：對采集的標本應立即送檢，特別是深部真菌標本采集后最長不超過2h。,真菌的檢驗方法,真菌形態(tài)學檢查真菌抗原檢測真菌分離培養(yǎng)與鑒定真菌核酸檢測真菌毒素檢測,真菌形態(tài)學檢查,直接鏡檢：方法簡便，快速,,10%KOH,微加熱,低倍/高倍鏡檢查菌絲/孢子,角質(zhì)標本（皮膚癬菌）,染色后觀察 假絲酵母菌--取材涂片，革蘭染色 隱球菌--

13、腦脊液離心取沉淀涂片，墨汁負染,,腦脊液涂片-新生隱球菌,表皮癬菌,真菌的直接涂片檢查,常用的染色方法,常用的染色方法有革蘭染色、瑞氏染色、熒光染色，乳酸酚棉藍染色、還有墨汁負染色等。對檢測骨髓和外周血中的莢膜組織胞漿菌，需作瑞氏染色或姬氏染色后鏡檢。檢測病人腦脊液標本中新生隱球菌，需作墨汁負染色后檢查，背景為黑色，新生隱球菌和莢膜不著色,直接鏡檢意義,結(jié)果判斷：組織中分隔分枝的菌絲為曲霉; 粗大、不分隔或不分枝的菌絲為毛霉。皮膚癬

14、菌菌絲肥大粗長為處于活躍狀態(tài)。酵母型和二相型真菌在組織內(nèi)常為孢子。陽性結(jié)果有診斷意義，如淺部真菌病、隱球菌病、皮膚粘膜假絲酵母菌病等代表組織相，直接鏡檢看到的真菌形態(tài)就是該真菌的組織形態(tài)，如假絲酵母的菌絲、淺部真菌的厚膜孢子等；確定某些致病性真菌屬或種，如皮膚癬菌、曲霉等判斷某些真菌種的致病性等,直接鏡檢的局限性,陰性結(jié)果不能排除真菌感染，直接鏡檢不如培養(yǎng)敏感，其敏感性隨標本類型、數(shù)量、采集時間和質(zhì)量等而有所不同 有假陽性結(jié)果，

15、如溶解的淋巴細胞在腦脊液印度墨汁濕片中易誤認為新生隱球菌；脂肪微滴也可與出芽酵母細胞混淆,抗原檢測,采用免疫學方法檢測真菌抗原，常用的方法有膠乳凝集試驗、ELISA、半定量放射免疫測定法。,真菌的分離培養(yǎng),真菌培養(yǎng)是目前鑒定真菌的唯一方法。培養(yǎng)成功與否與采集的標本是否適當、是否新鮮、培養(yǎng)基的選擇、培養(yǎng)溫度與時間等有關(guān)。大多數(shù)真菌培養(yǎng)的溫度為28℃，但深部真菌為37℃。對二相性真菌培養(yǎng)時, 28℃培養(yǎng)真菌呈菌絲相（霉菌型），37℃培養(yǎng)

16、為組織相（酵母型）。平皿培養(yǎng): 表面較大可使標本散布，便于觀察菌落形態(tài)，但水分易蒸發(fā)，只能培養(yǎng)生長繁殖較快的真菌，如假絲酵母菌、隱球菌。 大試管培養(yǎng): 水分不易蒸發(fā)，主要用于皮膚癬菌的培養(yǎng)和真菌菌種的保存。玻片培養(yǎng)(微量培養(yǎng)、小培養(yǎng)): 可用于真菌菌種的鑒定。,觀察菌落形態(tài)時注意,菌落性質(zhì)，是酵母菌還是霉菌。菌落大小,一般病原性真菌菌落小，而條件致病性真菌菌落大。菌落顏色，一般病原性真菌顏色淡，污染真菌顏色深。致病性真菌菌落

17、下沉，污染性真菌菌落不下沉; 致病性真菌有時使培養(yǎng)基開裂，但污染霉菌很少引起培養(yǎng)基開裂。,真 菌 鑒 定,菌落觀察形態(tài)學觀察生化反應：糖(醇)類發(fā)酵試驗、同化碳源試驗、同化氮源試驗、硝酸鉀試驗利用、牛乳分解試驗、酚氧化酶試驗、明膠液化試驗和脲酶試驗等。主要用于檢驗深部感染真菌如假絲酵母菌、隱球菌等。分子生物學鑒定,動物試驗: 分離病原性真菌、確定真菌菌種的致病性、研究藥物對真菌的作用等。 核酸檢測: 操作簡便、省時省工、敏感性和

18、特異性高的優(yōu)點，但要一定的實驗條件，并大多仍處于實驗研究階段，故目前不可能完全替代常規(guī)鑒定方法 。真菌毒素的檢測: 生物學方法、薄層層析法、高效液相色譜法和間接競爭ELISA法等。,真菌非培養(yǎng)檢測技術(shù),多烯類抗生素，如兩性霉素B、制霉菌素、曲古霉素等。吡咯類，包括酮康唑、伊曲康唑、氟康唑、伏立康唑、克霉唑、益康唑等。其他類如氟胞嘧啶。,抗真菌藥物分類--化學結(jié)構(gòu)分類,抗真菌藥物分類--化學結(jié)構(gòu)分類,作用于真菌細胞膜：兩性霉素B、制

19、霉菌素、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、酮康唑及克霉唑等。作用于真菌細胞壁：尼可霉素Z、卡泊芬凈及普拉米星（pradimicin）等。作用于真菌核酸：干擾真菌DNA合成，5－氟尿嘧啶（5－FC）等。其他：大蒜新素（allitridum）及冰醋酸（glaciale acetic acid）等。,抗真菌藥物分類--作用機理分類,兩性霉素B：兩性霉素對大多數(shù)深部致病真菌具有活性，如念珠菌、新型隱球菌、曲菌、組織胞漿菌、雙向真菌等均有較強的抑

20、制作用。但對皮膚和毛發(fā)癬菌大多耐藥。酮康唑(ketoconazole) 對念珠菌、著色真菌 屬、球孢子菌屬等有抗菌活性，對毛發(fā)癬菌亦具抗菌活性。氟康唑(fluconazole) ：對念珠菌、隱球菌 具有較高抗菌活性。氟胞嘧啶：為窄譜抗生素，對念珠菌、新型隱球菌和球擬酵母有較高抗菌活性，對其他真菌抗菌作用差，易產(chǎn)生耐藥性，故常和兩性霉素B聯(lián)合使用。,臨床常用抗真菌藥物,抗真菌藥物藥敏試驗原則,提供兩種以上有相當活性的抗真菌藥

21、物的可信測量方法和體內(nèi)的活性具有相關(guān)性，可預測治療的效果可用來監(jiān)控敏感群體菌株的耐藥性發(fā)生可預期研究新藥的潛在治療效能。,真菌藥物敏感試驗過程,方法:肉湯稀釋法，包括常量稀釋法和微量稀釋法。 培養(yǎng)基:含谷氨酰胺和pH指示劑，不含碳酸氫鈉RPMI 1640培養(yǎng)基。程序:藥物原液配制 接種菌液制備 藥液稀釋 常量稀法 微量稀釋法 結(jié)果判斷 質(zhì)量控制,,,,,,取　材　

22、 接種動物　 接種途徑　 潛伏期 動物病變白假絲　　 痰、尿　　　 家兔、　　　耳靜脈、 3~5d　　腎臟明顯腫脹，腎　　　　酵母菌病　 便、血　　　 小白兔　　　腹腔　　　　 　皮質(zhì)部位有白色膿瘍　　新生隱球　 腦脊液、　　 小白鼠　　　顱內(nèi)、 2~8周　 死亡。取標本涂片、　　菌病　　　 膿、痰、尿 　　　　　　 腹腔　　　　

23、 墨汁負染色見帶莢膜　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　孢子絲　　 膿汁、痰液　 大、小　　　腹腔、 1~3周　 腸系膜、腹膜有肉芽菌病　　　 活體組織、　小白鼠　　　睪丸組織 形成，睪丸腫大?。ㄍ?

24、 片見G+圓形、卵圓形 “雪茄煙“狀小體） 　　　著色真　　膿汁、培養(yǎng)物　 大白鼠　　 腹腔、　　　　　　 肺、腎、腹腔呈肉芽　　　菌病　　　　、活體

25、組織　 小白鼠　　 睪丸、靜脈　數(shù)周　　 腫損害　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　組織胞　　　血、骨髓、　大白鼠　　 腹腔、　　　　　　 死亡、肝、脾、腎淋　　　漿菌病　　　痰、皮膚　　小白鼠　　 顱內(nèi)　　 1~2周　 巴結(jié)呈肉芽腫損害。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 涂片，于巨噬細胞和　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　大單核細胞內(nèi)可查到本菌　

26、　球孢子　　 血液、骨髓、　小白鼠、　腹腔、　 1~2周　 死亡?？蓮母?、脾、肺等　　　　　菌病　　　痰、皮膚　　　 豚鼠　　　 睪丸　　　　　　器官及腹膜找到本菌。睪 丸膿腫可見典型的球菌,常見深部真菌病動物試驗鑒別