艾滋病抗體檢測技術免疫印跡法及質量控制黎俊宏

1、艾滋病抗體檢測技術（免疫印跡法）及質量控制,黎俊宏檢測檢驗中心艾滋病確證實驗室,常州市疾病預防控制中心,Changzhou Center for Disease Control and Prevention,全國艾滋病檢測技術規(guī)范（2015年修訂版）第六章 艾滋病病毒感染實驗室檢測策略,,我國自上世紀80年代發(fā)現(xiàn)第一例艾滋病病例至今，各地市艾滋病感染者呈逐年增長趨勢。 4 臨床診斷相關的檢測策略及結果報告

2、 4.1 使用抗體檢測試劑的檢測流程：,,4.3 補充試驗檢測策略補充試驗分為抗體確證試驗和HIV-1核酸試驗?？贵w確證試驗包括免疫印跡試劑（WB）和條帶/線性免疫試驗（RIBA/LIA）， 特定條件下的替代檢測（三種酶聯(lián)免疫試驗、三種快速試驗或者酶聯(lián)免疫加快速試驗），免疫層析或免疫滲濾試驗。HIV-1核酸試驗包括定性和定量試驗。,*兩種試劑可以是原有試劑加另一種試劑， 也可以是兩種不同試劑。,全國艾滋病檢測技術規(guī)范（2

3、015年修訂版）第六章 艾滋病病毒感染實驗室檢測策略,,全國艾滋病檢測技術規(guī)范（2015年修訂版）第六章 艾滋病病毒感染實驗室檢測策略,HIV確證試驗的方法,,,,,,,2,,,3,,,1,,,4,LIA 條帶免疫試驗,RIPA 放射免疫沉淀試驗,IFA 免疫熒光試驗,WB 免疫印跡試驗,HIV抗體WB試驗具有很高的敏感性和特異性，是國內HIV抗體確證的金標準。,RIBA/LIA 條線/線性免疫試驗,,West

4、ern Blot與Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳 ，被檢測物是蛋白質，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（例如NC膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影

5、以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。,WB的原理,,,WB檢測HIV抗體的原理,硝酸纖維試劑膜條上結合了天然滅活的HIV-1型病毒蛋白的分離顆粒和特異性的HIV-2型合成多肽。在膜條分別加入稀釋的血清或血漿樣本或對照，孵育。如果樣本中含有HIV-1和HIV-2型的特異性抗體，則抗體會與試劑膜條上的HIV-1蛋白和HIV-2多肽結合，通過清洗去除試劑膜條上的未結合物，與HIV蛋白特異性結合的抗體再通過與帶有堿性磷酸酶的羊抗人Ig

6、G抗體結合，加入BCIP/NBT底物等一系列反應即可顯色。,全病毒裂解液電泳得到的膜條,,,在HIV顆粒中，外膜蛋白（env）基因編碼的一個蛋白經(jīng)糖基化后形成包膜蛋白前體（gp160），其在蛋白酶作用下裂解成外膜蛋白（gp120）和跨膜蛋白（gp41）；核心蛋白（gag）基因編碼的前體蛋白（p55）被蛋白酶裂解為衣殼蛋白（p24）和內膜蛋白（p17），p39為p55的碎片；逆轉錄酶蛋白（pol）基因編碼的逆轉錄酶（p66、p51）和核酸

7、內切酶（p31），而機體對上述HIV蛋白產(chǎn)生相應的抗體，又在WB中出現(xiàn)相應的不同組合的帶型。 這既是確證HIV抗體陽性的條件，又能作為HIV感染期和AIDS期的參考依據(jù)。,,HIV模型圖,脂雙層膜,gp120,gp41,包膜糖蛋白,p24衣殼蛋白,p17內膜蛋白,p7核衣殼蛋白,逆轉錄酶,蛋白酶,整合酶,,,,,,,,,,,,,,,env編碼 外膜蛋白gp120 跨膜蛋白gp41（包膜蛋白前體gp160為gp

8、41聚合體）,,,?,env基因的結構及env蛋白,gag基因的結構及gag蛋白功能,gag基因編碼病毒核心蛋白 前體蛋白p55（p39為p55的碎片）、衣殼蛋白p24、內膜蛋白p17,,,?,pol基因的結構及pol蛋白,pol基因編碼的酶類p66和p51蛋白為逆轉錄酶p32蛋白則為整合酶P11蛋白為蛋白酶,,?,,嚴格遵守實驗室標準操作程序(SOP),確證試驗的要點,嚴格按照試劑盒說明書操作,嚴格控制防止樣品間的交

9、叉污染,,試劑,MP生物醫(yī)學亞太私人有限公司（MP）HIV-1/2混合型試劑（MP HIV BLOT 2.2）上海英旻泰生物技術有限公司（IMT）HIV-1/2混合型試劑（IMT HIV-1/2 Blot）,實驗藍圖,實驗原始記錄,,結果的判定,首先要確定可見到標本質控帶.如果標本質控帶是陰性,則檢測無效;因為這表示技術上有錯誤,如未加樣本,酶結合物或底物液。與強和/或弱陽性對照試劑膜對照,確定檢測試劑膜上每一條帶的分子

10、量。按照試劑盒說明書判定標準，判斷待測樣品為陽性、陰性或不確定。,,HIV-1抗體陽性 檢測出2條env帶（gp160/gp41和gp120）及gag（p17，p24，p55）或pol（p31，p51，p66）HIV抗體陰性 沒有病毒的特異性條帶或只檢測出p17抗體HIV抗體不確定 出現(xiàn)任何病毒特異條帶，但不足以判斷為陽性,試劑盒說明書,,技術規(guī)范（2009版）,HIV-1抗體

11、陽性 至少有2條env帶（gp41和gp160/gp120）出現(xiàn)，或至少1條env帶和p24帶同時出現(xiàn)。HIV抗體陰性 無HIV抗體特異帶出現(xiàn)。HIV抗體不確定 出現(xiàn)HIV抗體特異帶，但不足以判定陽性。HIV-2抗體血清學陽性出現(xiàn)HIV-2型特異性指示帶的樣品：如果同時呈HIV-1 抗體陽性反應，只需報告HIV-1 抗體陽性，不推薦進一步做HIV-2 抗體確證試驗；如果同時呈HIV-

12、1抗體不確定或陰性反應，需用HIV-2型確證試劑再做HIV-2的抗體確證試驗。同時符合以下二條標準，即出現(xiàn)至少2條env 帶（gp36和gp140/ gp105），和試劑盒提供的陽性判定標準，可判為HIV-2抗體陽性。,,HIV基因組,ENV區(qū) gp160:gp41的聚合體 寬的擴散糖蛋白帶 gp120:外膜蛋白 擴散糖蛋白帶 gp41:跨膜蛋白 擴散糖蛋白帶POL區(qū)

13、 p66:逆轉錄酶 細窄條帶 p51:逆轉錄酶 細窄條帶 p31:核酸內切酶 雙重條帶GAG區(qū) p55:前體蛋白 細窄條帶 p39:p55的碎片 細窄條帶 p24:核心蛋白 寬闊條帶 p17:核心蛋白 寬闊條帶,條帶,確證陽性,

14、首次確證不確定,孕婦第一次確證,MSM第一次確證,再次確證陰性,孕婦4周后隨訪確證結果,MSM4周后隨訪確證結果,From不確定to陽性,送檢時間：2011年1月送檢時間：2011年2月,,質量控制,第二章 HIV抗體檢測,7 質量控制 7.1 酶免或發(fā)光法抗體檢測的室內質量控制7.2 快速法抗體檢測質控,WB法HIV抗體確證實驗質控,7.1 酶免或發(fā)光法抗體檢測的室內質量控制7.1.1 試劑盒內部對照

15、7.1.2 室內質控品7.1.3 Levey-Jennings質控圖7.1.4 室內質控其他方式—“即刻法”質控,試劑盒內提供的陽性和陰性對照：判斷每次實驗的有效性，不能作為室內質控品使用；每次須有，且只能同批號試劑盒用；如無效，須重做。,非試劑盒組份的外部質控品：監(jiān)控檢測的重復性，且須為弱陽性；判斷該批臨床樣品檢測的可信性；每次須有；失控須重做?？少I或自制：穩(wěn)定、無菌、不含影響試劑反應的防腐劑。,第二章 HIV抗體檢測,

16、7.1.3 Levey-Jennings質控圖,7.1.3.1 質控圖參數(shù) 外部質控品的均值和標準差應建立在實驗室常規(guī)使用方法對外部質控品重復測定的基礎上。一般采用在不同批次檢測取得至少20個數(shù)據(jù)；如果僅做少量批次的檢測，也至少做5個批次的檢測，每個批次中不少于4個質控血清測定結果，以建立一個臨時性的均值和標準差，當達到20批次數(shù)據(jù)后，替代臨時性的均值和標準差。 （1）算術平均值（ ）：代表一組質控品測定S/CO值

17、的均值。為了統(tǒng)計學上有顯著性意義，應該采用至少20次（天）測得的外部對照質控品的S/CO值計算平均值。 （2）標準差（s）：是描述樣品與均數(shù)之間離散程度的一個指標，是與質控品S/CO值均值有關的預期范圍。一組S/CO值的標準差以s表示。 （3）變異系數(shù)（cv）：是反映各次S/CO值相對于均值離散程度的一個指標，可以用來衡量檢測的重復性或精密度。 （4）控制限：由實驗室根據(jù)對外部質控品檢測結果的均值和標準差來確定。例如，

18、按照12S質控規(guī)則，控制限為外部質控品S/CO均值加減2個標準差；按照13S質控規(guī)則，控制限為外部質控品S/CO均值加減3個標準差。,7.1.3 Levey-Jennings質控圖,7.1.3.2 質控規(guī)則 實驗室在報告結果之前必須評價質控數(shù)據(jù)，可通過圖形記錄的檢查或由計算機審核結果來決定。目前有許多質控規(guī)則，常用的是12S和13S規(guī)則。（1）告警（12S）：當外部質控品的S/CO值超出 +2s范圍時，系統(tǒng)處于告警狀態(tài)

19、，應予注意，是否可以繼續(xù)檢測需要進一步觀察。若將12S做失控標準，有較高的假失控概率，所以一般不采用。（2）失控（13S）：當外部質控品的S/CO值超出 +3s范圍時，系統(tǒng)處于失控狀態(tài)，本次實驗結果不能被接受，可能是系統(tǒng)誤差、隨機誤差或外部質控品 穩(wěn)定性下降所致。7.1.3.3 質控圖的分析及失控處理 實驗室應建立質控圖分析及失控情況處理的程序。當出現(xiàn)失控時，必須找出發(fā)生問題的原因，找出解除問題的方法，并消除原因。,外部

20、質控品？實驗操作？不同人員？儀器？（如加樣槍？洗板機堵孔？酶標儀未每年校準？）繪制質控圖錯誤？……,7.1.4 室內質控其他方式—“即刻法”質控,7.1.4 室內質控其他方式—“即刻法”質控,（1）當SI上限和SI下限 n3s值時說明該值已在3s范圍之外，屬“失控”。“即刻法”只能在前20次內使用，超出即可采用L-J質控圖方法。,第二章 HIV抗體檢測,7.2 快速法抗體檢測質控7.2.1 試劑內對照7.2.2 室內

21、質控品對照7.2.3 開展抗體相關檢測的實驗室須參加有資質機構組織的能力驗證，或室間比對。,質控窗口內的質控帶，試劑自帶內部過程質控：實驗操作全部完成且實驗所用材料處于工作狀態(tài)；清潔的檢測區(qū)背景是內部陰性過程質控；如未有紅色質控帶：試劑盒內質控無效，該結果無效，須重做。,外部質控品可商用或自制質控品：抗體陽性和陰性樣品；下列情況需做質控：更換試劑批號、檢測人員、包裝、試劑廠家。除此之外，建議每個檢測日檢測一次陽性和陰性質控品；如果日

22、檢測量大于50份樣品，至少應作2次質控。,出現(xiàn)以下問題，提示存在質量隱患，應引起重視：運輸包裝、內盒或試劑盒的物理損傷；在單包裝內存在混雜物質；標簽出現(xiàn)錯誤、缺失或字跡模糊 （特別是產(chǎn)品名稱或出產(chǎn)廠家名稱，批號和貨號，失效期或/和生產(chǎn)日期）；缺失目錄；泄漏或污染；不適宜的存放條件；保護包裝紙破損或污染；未達到質量控制標準 （陽性/陰性控制結果以及質控條帶出現(xiàn)與否等標志）；試劑質量問題須報告省確證中心實驗室。,WB法HIV抗體確證實驗質控

23、,一、室內質控: 儀器質控：儀器是否運轉正常，管路是否堵塞； 過程質控： 1、試劑質控，強陽、弱陽、陰性對照； 2、樣品質控，有無交叉污染，相鄰的槽道是否出現(xiàn)完全一樣的條帶； 3、數(shù)據(jù)質控，室溫25±3℃（ ＜20 ℃ 需開空調），結果判讀需兩名判讀人和一名審核人。二、外部質控：參加有資質機構組織的能力驗證，即室間比對，如全國艾滋病

24、檢測實驗室HIV抗體血清學能力驗證。,條帶位置,試劑批號不同甚至同一批號不同盒子，同一條帶的位置并不是相同的,,早期感染帶型？（疑似）,Gp160+p24 gp120很弱或者沒有或還有其他,,,早期感染帶型？（疑似）,,,早期感染帶型？（疑似）,,,進展帶型？,,AIDS（晚）期帶型？,ENV帶強度保持恒定，p24缺失或強度明顯降低,AIDS（晚）期帶型？,,,第二章 HIV抗體檢測6.2 確證報告6.2.1 WB及 RIBA

25、/LIA報告,,,,,,急性期,,無癥狀期,窗口期,HIV抗原、抗體變化圖,,Anti-P24,Anti-gp41/120(anti-gp36),HIV RNA,Anti-Ag,,,1周 2周…..1月 2月………………….1年 2年 3年…………….10年………..,,艾滋病期,Anti-Ab,,,獻血員中一例陽性,送檢時間：2010年12月,備注：9.13獻血，酶免陰性，核酸陽性。12.18檢測，酶免陽性，核

26、酸陽性。建議仔細詢問發(fā)生高危行為的時間。,工欲善其事必先利其器,加樣器的使用,準備,設定移液量,安裝吸頭,,按壓至第一停點位置,吸液,貼壁,輕輕按壓放液,貼壁,按壓至第一停點后，再按壓第二停點，排盡吸頭殘余液體,松開按鈕，彈回至原來的位置,按壓吸頭推頂，退除吸頭,加樣器的使用,正向加樣法,反向加樣法,加樣器-注意事項,根據(jù)所需取液量選擇相應的移液器及吸頭，使用帶濾芯的吸頭，可防止交叉污染。,日本W(wǎng)ATSON ：低吸附、高精度、無RN

27、A酶、無DNA酶、無熱源、加長吸頭 、帶濾芯已消毒,,吸取液體時應緩慢勻速吸取，避免液體濺到移液器頭上；打出液體后拇指不應松開按鈕，將吸液嘴壓掉后再將拇指松開，避免液體回吸。在調整取液量的旋鈕時，不要用力過猛，并應注意計數(shù)器顯示的數(shù)值不要超過其可調范圍。連續(xù)可調式移液器不可在無吸頭時使用，吸頭有液體時不可平放或倒置。,加樣器-注意事項,,操作時要慢和穩(wěn)，吸嘴浸入液體深度要合適，吸液過程盡量保持不變；改吸不同液體、樣品或試劑前

28、要換新吸嘴；發(fā)現(xiàn)吸嘴內有殘液時必須更換；新吸嘴使用前應先預測。為防止液體進入移液器套筒內，注意以下幾點：壓放按鈕時保持平穩(wěn)；移液器不得倒轉；吸嘴中有液體時不可將移液器平放；5ML及10ML移液器一定要加濾芯。切勿用油脂等潤滑活塞或密封圈。使用了酸性或有腐蝕蒸氣的溶液后，最好拆下套筒，用蒸餾水清洗活塞及密封圈。,,加樣器-注意事項,,連續(xù)可調式移液器在取樣加樣過程中應注意移液嘴不能觸及其他物品，以免被污染；移液嘴盒（架子

29、）、廢液瓶、所取試劑及加樣的樣品管應擺放合理，以方便操作過程、避免污染為原則。連續(xù)可調式移液器在使用完畢后應置于移液器架上，遠離潮濕及腐蝕性物質。在取液之前，所取液體應在室溫（15-25?C）平衡；液體溫度與室溫有異時，將吸嘴預洗多次再用；移液溫度不得超過70℃。,,加樣器-注意事項,加樣器-常規(guī)維護,,加樣器應根據(jù)使用頻率進行維護，但至少應每3個月進行一次，具體方法如下：1．一般維護可用中性洗滌劑（如洗餐具用的洗滌靈）

30、清潔，或者用60%的異丙醇，然后用蒸餾水反復洗滌，去除洗滌劑或異丙醇，晾干。清潔后活塞處可使用一定量的潤滑劑。2．如果有液體進入加樣器內的嚴重污染，可以將加樣器拆開后進行清潔，具體拆開步驟參照加樣器說明書（不同的加樣器的拆開方式有所不同）。3．高壓消毒，有的加樣器的吸管部分可高壓消毒（121℃，20分鐘），如Eppendor的Research單道可調加樣器。但消毒時不可超溫超時，也不能擠壓放置，以免造成變型。,定期校準：有資

31、質的服務商提供校準服務，并貼已校準標簽。,AIDS,confirmation laboratory,艾滋病確證實驗室,AIDS,confirmation laboratory,艾滋病確證實驗室,海恩法則,“每一起嚴重事故的背后，必然有29次輕微事故和300起未遂先兆以及1000起事故隱患?！?——德國人帕布斯?海恩（德國飛機渦輪機的發(fā)明者 ）,兩點：一是事故的發(fā)生是量的積累的結果；二是再好的技術，再完美的規(guī)章，在實際操作層面，也