微生物生產(chǎn)抗生素

1、資料收集：PPT制作：PPT演講：,微生物生產(chǎn)抗生素類藥,目錄,,,,,,,,一. 抗生素定義,傳統(tǒng)的定義：抗生素（antibiotic）是微生物細胞產(chǎn)生的能以低濃度抑制其他微生物細胞生長的化學物質。 現(xiàn)代定義：抗生素是生物細胞（包括某些微生物﹑植物和動物）產(chǎn)生的能以低濃度抑制其他生物細胞生長或功能的化學物質。,概 述,抗生素是某些生物產(chǎn)生的具有生物活性的物質，它不但可以抑制其他微生物的發(fā)育與代謝，有的還可以抑制癌的發(fā)育與代謝

2、，及具有抗血纖維蛋白溶酶作用。 抗生素是人們使用最多的藥物，也是制藥工業(yè)中利潤最高的產(chǎn)品。世界各國由發(fā)酵法生產(chǎn)的抗生素約400種，廣泛應用的僅120種，其他主要是毒性大、成本高，無商業(yè)應用價值。 抗生素生產(chǎn)為近代微生物技術中最大產(chǎn)業(yè)之一，世界產(chǎn)量超過35000噸，不但在經(jīng)濟上占有重要位置，且為人類健康作了出巨大貢獻。,概 述,第二次世界大戰(zhàn)期間 ,英美科學家在早年 Fleming發(fā)現(xiàn)青霉素的基礎上 ,共同進行了青

3、霉素的開發(fā) ,用紫外光照射處理低產(chǎn)菌種 ,提高其產(chǎn)青霉素的能力 ,采用玉米漿作為培養(yǎng)基的氮源 ,從而成功地開始了青霉素的工業(yè)生產(chǎn) ,并建立了深層發(fā)酵技術 ,這是發(fā)酵工業(yè)的一次革命 ,成為抗生素生產(chǎn)的開端。抗生素的工業(yè)化生產(chǎn)主要是利用微生物發(fā)酵法，極少數(shù)抗生素如磷霉素可用法學法生產(chǎn)。此外還用天然產(chǎn)生的抗生素進行化學結構改造，制造各種衍生物。,二、抗生素的生物來源,,微生物產(chǎn)生抗生素,1、放線菌產(chǎn)生的抗生素：鏈霉菌屬：放線菌素、鏈霉素等

4、。小單抱菌屬：紅霉素（大環(huán)內酯類）、新霉素（氨基環(huán)醇類）諾卡氏菌屬：肌霉素（氨基環(huán)醇類）、諾卡氏菌素放線菌中以鏈霉菌屬產(chǎn)生的抗生素最多，諾卡菌屬較少。,2、細菌產(chǎn)生抗生素芽孢桿菌屬：多粘芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌假單胞菌屬：銅綠假單胞菌（綠膿桿菌）桿菌肽、粘桿菌素、多黏菌素等多肽類。3、真菌產(chǎn)生抗生素青霉屬：青霉素、灰黃霉素。頭孢菌屬： 頭孢霉素,其他生物（動植物）產(chǎn)生抗生素,植物產(chǎn)生的抗生素，如地衣和藻類植物產(chǎn)生的地衣

5、酸和綠藻酸，從被子植物如蒜和番茄等植物的組織或果實中制得的蒜素和番茄素，裸子植物如銀杏、紅杉等也能產(chǎn)生抗生物質。動物的多種組織能產(chǎn)生溶菌酶或一些抗生素，如從動物的心、肺、脾、腎、眼淚、涎水中可提取出色素，有抗菌及抗病毒等作用。,三、抗生素產(chǎn)生菌的選育 1、抗生素產(chǎn)生菌的分離 2、抗菌性試驗 3、抗生素產(chǎn)生菌的改良 1)人工誘變 2)原生質體融合 3)體外DNA重組,體外DNA重組,,四、抗

6、生素的提純,微生物在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物，包括各種初級代謝產(chǎn)物和次級代謝產(chǎn)物以及培養(yǎng)基的固有成分，這些成分的存在影響抗生素的使用效果，本身具有毒副作用，造成儲存困難，必須經(jīng)過精制。,⑴抗生素提純的基本步驟和原則3個基本步驟：發(fā)酵液過濾和預處理、粗純化、精制4個原則：時間盡量短；采用適當較低濃度；條件適宜，pH適度，溫度適宜；防止雜菌污染。⑵提取方法： 吸附、萃取、離子交換、沉淀、色譜分離、分子篩過濾、透析等。,抗生素的

7、提純,五、青霉素的發(fā)酵工藝,1、青霉素的作用機制、抗菌譜及穩(wěn)定性,作用機制：抑制細菌的轉肽酶，阻止細胞壁合成中的交叉連接步驟，使處于繁殖分裂期的細菌細胞壁的合成發(fā)生障礙，導致菌體細胞壁損壞，使細胞內因滲透壓等原因發(fā)生溶解而死亡?？咕V：作用于大多數(shù)革蘭氏陽性細菌及部分革蘭氏陰性細菌。穩(wěn)定性：弱酸性的有機化合物，干燥純凈的青霉素鹽很穩(wěn)定，pH5-7，6最穩(wěn)定。,2、菌種,青霉素作為第一個具有臨床應用價值的抗生素，1928年被發(fā)現(xiàn)，19

8、43年在美國被首次實現(xiàn)工業(yè)生產(chǎn)。最早發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)生青霉素的原始菌種是點青霉菌，生產(chǎn)能力很低，發(fā)酵單位2U/mL，不能滿足工業(yè)生產(chǎn)要求，所以被淘汰。現(xiàn)在主要采用的是產(chǎn)黃青霉菌，目前國際上青霉素生產(chǎn)最高發(fā)酵單位80000-90000U/mL.,2、菌種,生產(chǎn)菌種按其在深層培養(yǎng)中菌絲形態(tài)分為：絲狀菌和球狀菌；根據(jù)絲狀菌產(chǎn)生孢子的顏色又分為黃孢子絲狀菌和綠孢子絲狀菌。常用菌種為綠孢子絲狀菌，如產(chǎn)黃青霉菌。,為了提高產(chǎn)黃青霉菌的青霉素產(chǎn)量，使用誘變

9、劑如：二環(huán)氧丁烷、甲磺酸乙酯、乙烯亞胺、亞硝酸、X射線等。,3、當前青霉素的生產(chǎn)工藝流程,一般而言，青霉素的生產(chǎn)工藝流程需要有四個環(huán)節(jié) 。 第一個環(huán)節(jié)是通過培養(yǎng)基配制、蒸汽滅菌等工藝手段將原料加工為一級種子罐。與此同時，還要將青霉素菌、 斜面母瓶、米孢子等經(jīng)過相應處理后加入到一級種子罐中。 第二個環(huán)節(jié)是利用培養(yǎng)基配制和蒸汽滅菌等處理手段將原料培養(yǎng)成二級種子罐。第三個環(huán)節(jié)是在第二個環(huán)節(jié)的基礎上加上發(fā)酵罐的處理，形成發(fā)酵液。最后一個環(huán)節(jié)則是

10、將上述所獲得的發(fā)酵液放在帶放罐中，獲得最終的發(fā)酵液，完成青霉素的發(fā)酵制備 。,青霉素發(fā)酵工藝流程及發(fā)酵控制,,（1）孢子制備,先將保存在砂土中的菌種孢子取出，在由甘油、葡萄糖以及蛋白胨所制備而成的培養(yǎng)基中進行斜面培養(yǎng)，經(jīng)傳代和活化。培養(yǎng)溫度控制在26℃左右（最利于菌種孢子傳代活化的適宜溫度）。培養(yǎng)7d左右，得到單菌落之后，再傳斜面，以同樣的方式培養(yǎng)7d。然后就可以將所獲得的斜面孢子移植到優(yōu)質小米或大米固體培養(yǎng)基上，25 ℃，相對濕度45

11、%-50%，培養(yǎng)7d，得到最終的生產(chǎn)孢子。所獲得的生產(chǎn)孢子應該經(jīng)過搖瓶試驗后，確定其效價與雜菌情況均符合相關規(guī)定后方可用于下一環(huán)節(jié)生產(chǎn)。 可在孢子成熟后進行真空干燥，低溫保存?zhèn)溆谩?一級種子發(fā)酵：發(fā)芽罐，孢子萌發(fā)，形成菌絲培養(yǎng)基：葡萄糖、玉米漿、碳酸鈣、玉米油、消沫劑等。接種量： >200億孢子/噸培養(yǎng)基空氣流量：1：3 （m3/m3·min）攪拌轉速：300-350 r/minpH：自然溫度：2

12、7±1℃時間：40h,（2）種子罐培養(yǎng)工藝,（2）種子罐培養(yǎng)工藝,二級種子罐：繁殖罐，大量繁殖培養(yǎng)基：葡萄糖、玉米漿，玉米油，消沫劑等接種量：10%空氣流量： 1：1-1.5 （m3/m3·min）攪拌轉速： 250-280 r/minpH：自然溫度：25±1 ℃時間：10-14h,（3）生產(chǎn)罐培養(yǎng)工藝,三級罐：發(fā)酵罐培養(yǎng)基： 花生餅粉、葡萄糖、尿素、硝酸銨、硫代硫酸鈉、苯乙酰胺、碳酸

13、鈣、玉米油、硅油溫度控制：變溫控制，不同階段不同溫度 較高溫度（26℃），縮短生長時間；降低溫度（22℃），利于青霉素合成。pH：6.4-6.6左右 根據(jù)pH補糖（補糖可是pH上升）空氣流量: 1:0.8-1.5 （m3/m3·min）攪拌速度：150-200r/min,發(fā)酵罐示意圖,攪拌器,冷卻水進口,放料口,無菌空氣,培養(yǎng)液,冷卻水出口,排氣口,pH檢測及控制裝置,電動機,加料口,,,,,,,,,,,,

14、菌絲生長速度與形態(tài)、濃度,發(fā)酵穩(wěn)定期，濕菌濃度可達15%-20%，絲狀菌干重約3%，球狀菌干重在5%左右。在發(fā)酵中后期一般每天放液一次，每次放掉總發(fā)酵液的10%左右。,消沫,天然油脂：玉米油；化學消沫劑：泡敵前期：主間歇攪拌，少加油中期：攪拌、加油、稍微降低通氣量（必要時，少量多次)后期：盡量少加消沫劑,青霉素的發(fā)酵過程控制十分精密，一般2小時取樣一次，測定發(fā)酵液的pH、菌濃、殘?zhí)?、青霉素效價等指標，同樣取樣做無菌檢測，發(fā)現(xiàn)染菌立

15、即結束發(fā)酵，視情況過濾提取，因為染菌后pH波動大，青霉素在幾小時內就會被全部破環(huán)。,(4)青霉素的提取工藝,青霉素不穩(wěn)定，遇酸、堿、熱分解失活水溶液中不穩(wěn)定，非極性溶劑中穩(wěn)定易溶于有機溶劑，水中溶解度很小青霉素鹽很穩(wěn)定；降解產(chǎn)物具有致敏性防止降解，條件溫和、快速,青霉素的提取工藝,發(fā)酵液預處理→萃取→脫色→反萃取→過濾洗滌→干燥（發(fā)酵液中，青霉素濃度較低 10-30kg/m3） ①發(fā)酵液預處理：濃縮目的產(chǎn)物，去除大部分雜志，

16、改變發(fā)酵液的流變學特征，利于后續(xù)的分離純化過程 a. 加絮凝劑使蛋白質沉淀 b. 過濾（鼓式真空過濾機）,,活性炭,②萃取工藝過程：二級逆流萃取A、萃取原理： 分配定律，青霉素在水中溶解度小，易溶于醋酸丁酯、醇等有機溶劑中，青霉素鹽易溶于水，不溶于有機溶劑。 青霉素在濾液中以鹽存在，加入酸和醋酸丁酯，溶于有機相中，在醋酸丁酯中加入碳酸鉀，6.8-7.4，形成鹽轉入水相中，實現(xiàn)反萃取。,B、影

17、響萃取因素pH：反復調節(jié)pH，青霉素不穩(wěn)定，易發(fā)生降解、異構化、重排，β-內酰胺環(huán)是功能性。溫度：加熱會加快其降解反應工藝過程及濃縮倍數(shù)，級數(shù)越高、純度越高但收率越低。微生物污染：雜菌：β-內酰胺酶和青霉素酰胺酶萃取時間：青霉素在水中的半衰期18.5min。,(5)青霉素的精制 制成堿金屬鹽：堿金屬鹽穩(wěn)定性大；青霉素在水中的穩(wěn)定性差，水解快。1)結晶工藝：A、醋酸丁酯中直接結晶：加入醋酸鉀--乙醇--碳酸鉀、丁

18、醇--水真空共沸蒸餾。B、丁醇-水共沸結晶：青霉素的堿金屬鹽溶于水，在丁醇中不溶解，穩(wěn)定，丁醇和水形成二元共沸物蒸出，丁醇帶出水分，不斷加入丁醇，可使水分不斷減少，結晶析出。2)過濾、洗滌、干燥 結晶后用真空抽濾來處理母液，并用丁醇洗滌。干燥采用真空雙錐旋轉干燥器,(6)溶媒回收 采用立式傳質塔蒸餾回收。,一、斜面培養(yǎng)： 淀粉1％，硫酸銨0.3％、玉米粉0.6～1.0％、氯化鈉0.3％、蛋白胨0.2％、瓊脂2％、

19、pH7.0～7.237℃培養(yǎng)7～10d，成熟的孢子灰色略帶微紅色。一級種子培養(yǎng)： 豆餅粉2.5％、葡萄糖3％、淀粉4％、蛋白胨0.5％、酵母粉0.5％、硫酸銨0.5％、 ％、玉米粉0.2％、氯化鈉0.3％、磷酸氫二鉀0.06％、硫酸鎂0.025％、豆油0.3％35 ℃培養(yǎng)72h，菌絲密集,六、紅霉素的發(fā)酵生產(chǎn),二級種子： 豆餅粉2.2％、葡萄糖3％、淀粉4％、蛋白胨0.5％、酵母粉0.5％、硫酸銨0.1％、玉米粉0.8％、

20、氯化鈉0.3％、碳酸鈣0.6％、豆油0.3％35℃，24h，接種量10％二、發(fā)酵罐培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基： 豆餅粉2.4％、葡萄糖3％、3.5％、蛋白胨0.5％、酵母粉0.5％、硫酸銨0.1％、玉米粉0.8％、氯化鈉0.3％、碳酸鈣0.6％、豆油0.15％，丙酸0.6％（分次加入）60h前35℃，60h后33 ℃,菌絲繁殖期：接種45h后，菌絲生長快，繁殖旺盛，迅速利用N、C，菌絲體密集成網(wǎng)狀。紅霉素分泌期：45h～150h，

21、菌絲體生長減弱，并達到平衡，pH在7.2左右，c源利用較快，紅霉素持續(xù)分泌。菌絲自溶期：菌體衰老，發(fā)酵液顏色較深，菌絲短，粘稠度較大，pH上升7.5，氨基氮上升。,三、紅霉素的提取和精制,紅霉素是一種有機堿化物，在堿性條件下溶于有機溶劑中，在酸性條件下溶于水中。,提取工藝,發(fā)酵液 過濾 濾液 酸化液,,加甲醛、硫酸鋅,pH8.2～8.8,(26000 r/ml)

22、,,加氫氧化鈉靜止,堿化,,調節(jié)pH10～10.5,,分層、離心,,醋酸調節(jié)pH5～5.5,靜止分層,酸化液,5℃加丙酮,冷凍結晶,,結晶,,洗滌,干燥,成品,,1、發(fā)酵液預處理0.1～0.2％甲醛：殺菌使蛋白凝集變性4～6硫酸鋅：去除酸性蛋白，助濾并用堿液調節(jié)pH8.2～8.8，穩(wěn)定紅霉素2、濾液處理計算添加醋酸丁酯添加量，用堿液調節(jié)pH10～10.5，30～33℃左右，紅霉素溶解于有機溶劑中。,,,氣流干燥 80-90&