分子病理學(xué)常用研究技術(shù)原理及應(yīng)用

1、分子病理學(xué)常用研究方法原理及選擇,實(shí)驗(yàn)方法在科研工作中的意義,決定本項(xiàng)研究的意義與水平： ①高水平假說+高精尖手段→高水平的研究 ②高水平假說+一般手段→高水平的研究 ③低水平假說+高精尖手段→一般水平的研究 ④低水平假說+一般手段→低水平的研究,From Prof. XW Bian,工欲善其事必先利其器,立題的先進(jìn)性,手段的先進(jìn)性,科研水平先進(jìn)性,,選擇實(shí)驗(yàn)方法的基本原則,必要性,可行性,為什么要選擇這個(gè)方

2、法,替代方法,經(jīng)費(fèi),實(shí)驗(yàn)室條件,時(shí)間,基于硬件條件，選擇最具有說服力的方法,1．為沒有工作經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)學(xué)研究生編寫一本適合自學(xué)的手冊(cè)式教材，為他們做課題時(shí)更快、更好地選擇合適的實(shí)驗(yàn)技術(shù)提供決策參考。2．重點(diǎn)介紹同類實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展沿革、優(yōu)劣比較；不同實(shí)驗(yàn)技術(shù)的特點(diǎn)、用途、相互關(guān)系、發(fā)展趨勢(shì)；各類實(shí)驗(yàn)技術(shù)的關(guān)鍵、操作要點(diǎn)和選擇示范。3．重點(diǎn)強(qiáng)調(diào)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的原理與選擇，而非具體操作，亦非理論知識(shí)。,常用醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的種類及選擇,組織學(xué)實(shí)

3、驗(yàn)技術(shù),細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù),分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù),蛋白質(zhì)化學(xué)技術(shù),免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù),醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù),醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)原理及選擇,分子病理學(xué)常用實(shí)驗(yàn)方法,組織標(biāo)本取材與固定病理制片切片染色：常規(guī)/特殊原位蛋白質(zhì)檢測(cè)原位核酸檢測(cè),組織取材,固 定,不固定,凍存（不提倡）,凍存,包埋,冰凍切片,HE染色特殊染色I(xiàn)HCISH電鏡,蛋白質(zhì)、核酸提取,固定,不固定,分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn),-20℃保存,IF/IHC/ISH,,,,,,,

4、,,,,,,,,,,,,,,,組織標(biāo)本一般處理流程,細(xì)胞標(biāo)本一般處理流程,活細(xì)胞,細(xì)胞爬片,細(xì)胞離心涂片,細(xì)胞培養(yǎng),離心后包埋制片,凍存,細(xì)胞懸液,,,,,,,,,,,,,,,固定,形態(tài)學(xué)IHCISH,,Protein/DNA/RNA,分子生物學(xué),IF、FCM,,,,細(xì)胞取材方法適用范圍及優(yōu)缺點(diǎn)比較,組織固定,定義：將組織浸入適當(dāng)化學(xué)試劑，使細(xì)胞內(nèi) 物質(zhì)盡量接近其生理狀態(tài)時(shí)的形態(tài)結(jié)

5、 構(gòu)和位置的過程意義： 防止自溶 防止腐敗 最大限度保存細(xì)胞和組織的抗原性 保留特殊成分：糖原、核酸、色素等,組織固定的方法,蒸汽固定法,浸入法,灌注法,微波固定法,某些薄膜組織及血液或細(xì)胞涂片中的可溶物質(zhì),手術(shù)取材組織標(biāo)本和細(xì)胞涂片,僅適用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn),常用固定劑,醛類固定劑,非醛類固定劑,丙酮及醇類固定劑,雙功能交聯(lián)劑，可使組織間相互交聯(lián)，原位保存抗原對(duì)組織穿透力強(qiáng)，收縮

6、性小是最常用固定劑,10%中性福爾馬林液,4%多聚甲醛緩沖液,適用于多肽類激素的組織固定常需與戊二醛或多聚甲醛混合適用降低邊緣效應(yīng),穿透性很強(qiáng)，保存抗原活性較好常用于冰凍切片及細(xì)胞涂片固定,2.5%戊二醛（電鏡）,組織病理制片技術(shù),常規(guī)組織病理制片,脫水，透明，浸蠟，包埋，切片,組織病理制片技術(shù),組織芯片,近年來基因芯片（DNA芯片）技術(shù)的發(fā)展和延伸，與細(xì)胞芯片、蛋白芯片、抗體芯片一樣，屬于特殊生物芯片技術(shù),組織芯片技術(shù)可將數(shù)十個(gè)

7、甚至上千個(gè)不同個(gè)體的臨床組織標(biāo)本按預(yù)先設(shè)計(jì)的順序排列在一張玻片進(jìn)行分析研究，是一種高通量、多樣本的分析工具,科研人員可同時(shí)研究幾百甚至上千種不同階段病理生理狀態(tài)下的組織樣本的某一個(gè)或多個(gè)特定基因或相關(guān)表達(dá)產(chǎn)物,,,Tissue Microarray,組織病理制片技術(shù),顯微切割：microdissection,選取同質(zhì)性研究材料，是在對(duì)組織的深入研究中常常遇到卻又不易解決的問題,該技術(shù)是在顯微狀態(tài)下或顯微直視下通過顯微操作系統(tǒng)對(duì)選擇的材料

8、（組織、細(xì)胞、細(xì)胞群、細(xì)胞內(nèi)組分或染色體帶等）進(jìn)行切割分離并收集用于后續(xù)研究的技術(shù),細(xì)微：微米、納米級(jí)切割原位：所取材料定位清楚同質(zhì)：所取材料在一定層次上相同結(jié)合：與其他實(shí)驗(yàn)技術(shù)結(jié)合,顯微切割技術(shù)的特點(diǎn),顯微切割本身不能對(duì)樣品進(jìn)行研究，必須同其他實(shí)驗(yàn)技術(shù)結(jié)合，其切割目標(biāo)完全取決于研究目的,顯微切割的方式,手動(dòng)直接顯微切割,機(jī)械輔助顯微切割,液壓控制顯微切割,激光捕獲顯微切割（laser capture microdessec

9、tion, LCM）,全自動(dòng)組織處理機(jī),石蠟包埋機(jī),石蠟切片機(jī),震蕩切片機(jī),硬組織切片機(jī),冰凍切片機(jī),冰凍切片機(jī),常用組織切片染色方法,未經(jīng)染色的組織切片各部分折射率差別很小，即使有足夠的分辨率和合適的放大倍數(shù)，也無法直接在光鏡下觀察。通過適當(dāng)?shù)娜旧?，增大各部分結(jié)構(gòu)折射率差別，提高分辨率,蘇木精－伊紅染色（HE）,HE染色能非常鮮明地對(duì)組織和細(xì)胞染色，是最基本、使用最廣泛的技術(shù)方法，又被稱為常規(guī)染色。,DNA帶負(fù)電荷，呈酸性，與帶正電

10、荷的蘇木精堿性染料以離子鍵或氫鍵形式結(jié)合，呈藍(lán)色,伊紅Y為一種合成酸性染料，在水中離解成帶負(fù)電荷的陰離子，與嗜酸性物質(zhì)結(jié)合呈紅色,特殊染色,顯示HE染色不明顯的目的物，如Gridley染色能突出顯示感染的霉菌區(qū)別常規(guī)HE染色不能鑒別的病變，如V.G染色可區(qū)分膠原纖維和平滑肌顯示某些常規(guī)HE染色中不能看到的目的物，如網(wǎng)狀纖維、星形細(xì)胞的突起和結(jié)核桿菌等,結(jié)締組織染色,膠原纖維染色,Van Gieson氏苦味酸—酸性品紅染色法（簡(jiǎn)稱V.

11、G法）Masson氏三色染色法Mallory氏三色染色法Pollak氏三色染色法Sirius Red苦味酸法等,分布最廣、含量最多的一種纖維,來源于間胚葉的腫瘤如纖維瘤、平滑肌瘤、橫紋肌瘤、神經(jīng)纖維瘤及其肉瘤等的診斷和鑒別診斷。在慢性炎癥、機(jī)化和瘢痕形成等病變中顯示膠原纖維，如慢性腎小球腎炎的腎小球纖維化、大葉性肺炎、血栓機(jī)化、風(fēng)濕性肉芽腫時(shí)Aschoff’s巨細(xì)胞消失、胃、十二指腸潰瘍愈合、慢性闌尾炎、肝硬化。血管壁的膠原

12、纖維染色對(duì)病理診斷有重要意義。如良性高血壓的小動(dòng)脈玻璃樣變（V.G陽(yáng)性）；惡性高血壓小動(dòng)脈管型纖維素樣壞死（V.G陰性而纖維素染色陽(yáng)性）；高血壓性腎固縮，其小動(dòng)脈V.G陽(yáng)性呈紅色，而淀粉樣物質(zhì)沉積的小動(dòng)脈壁V.G染色呈黃色,膠原纖維染色的應(yīng)用,在病理診斷上主要用于和肌纖維相鑒別,結(jié)締組織染色,網(wǎng)狀纖維染色,是網(wǎng)狀結(jié)締組織內(nèi)的一種纖維，纖細(xì)而有分支，直徑約0.2~1mm，無彈性，穿行于細(xì)胞體之間，共同構(gòu)成網(wǎng)狀支架。HE染色不易辯識(shí)，用銀氨

13、溶液浸染能使纖維變成黑色，故稱嗜銀纖維,主要分布在淋巴組織、骨髓、扁桃體、胸腺、基底膜、血管（特別是毛細(xì)血管）、脾竇、肝竇、肌纖維周圍、神經(jīng)纖維、脂肪細(xì)胞周圍及肺泡等,結(jié)締組織染色,網(wǎng)狀纖維染色,Perdrau氏法、 Foot氏法、氫氧化銀液法、Wilder氏氫氧化銀液法、James氏法、Naoumemko-Feigin氏法、Del Rio-Hortega氏法、Hortega氏法、Bielschowsky氏法、Hamason-

14、Lushbangh氏法、醋酸氨銀染色法（汪榮法）和組織塊鍍銀法等,常用于區(qū)別癌和肉瘤：癌巢周圍常有網(wǎng)狀纖維包裹；用于基底膜染色，鑒別原位癌或原位癌早期浸潤(rùn)。鑒別血管內(nèi)皮瘤和外皮瘤：血管內(nèi)皮瘤瘤細(xì)胞呈泡巢狀，周圍被網(wǎng)狀纖維包繞；血管外皮瘤瘤細(xì)胞間可見較多網(wǎng)狀纖維。區(qū)別腦腫瘤：腦原發(fā)性肉瘤周圍有較多網(wǎng)狀纖維、腦血管周圍肉瘤組織內(nèi)有較多網(wǎng)狀纖維，其它腦腫瘤少見網(wǎng)狀纖維,網(wǎng)狀纖維染色的應(yīng)用,結(jié)締組織染色,彈力纖維染色,彈力纖維（Elasti

15、c fiber）廣泛分布于身體各處，以肺泡壁、動(dòng)脈壁和皮膚最為豐富。直徑約0.2~1mm，纖維分支，交織成網(wǎng)，電鏡下無周期性橫帶。對(duì)沸水、弱酸和堿有一定抵抗力，但可被胃液、胰液等消化,間苯二酚品紅法、醛品紅法、地衣紅法、Verhoeff氏法、Hart氏法、酸性地衣紅姬姆薩法、醛復(fù)紅阿辛藍(lán)法、堿性藍(lán)B染色法、彈力、膠原纖維的雙重組合染色法和顯示膠原、網(wǎng)狀和彈力纖維的三聯(lián)法,彈力纖維增生：原發(fā)性或繼發(fā)性高血壓的小動(dòng)脈、皮膚彈力纖維瘤、老年彈

16、力纖維增生癥、心內(nèi)膜彈力纖維增生癥、乳腺癌的彈力纖維增生等。彈力纖維斷裂、崩解：老年性肺氣腫、主動(dòng)脈粥樣硬化、梅毒性主動(dòng)脈炎、皮膚環(huán)狀肉芽腫等。,彈力纖維染色的應(yīng)用,肌肉組織染色,A.V.G法、Mallory三色染色法、Gomori多色染色法、Gomori氏改良多色染色法、鐵蘇木素法、偶氮桃紅染色法、橫紋肌的組織塊染色法、蘇木素堿性品紅苦味酸法、酸性復(fù)紅光綠染色法、酸性復(fù)紅染色法、CV-AF染色法和變色酸2R亮綠染色法等,未分化間葉性

17、腫瘤，如橫紋肌肉瘤的來源確定炎癥滲出纖維素、彌散性血管內(nèi)凝血的纖維素染色神經(jīng)膠質(zhì)瘤研究,脂類染色,中性脂肪（甘油三酯 ）染色,蘇丹Ⅲ、蘇丹Ⅳ、蘇丹黑及油紅O,膽固醇及膽固醇酯染色,硫酸鐵銨法、高氯酸萘醌法、醋酸銅脂肪酸染色法、酸性蘇木因染色法等,動(dòng)脈粥樣硬化病灶、腫瘤組織壞死灶、細(xì)胞內(nèi)類脂沉積、脂性腎病的腎小管、腎上腺皮質(zhì)中膽固醇類激素含量增減的測(cè)定,磷脂染色,由甘油、脂肪酸、磷酸和含氮的堿基組成，是細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)膜性結(jié)構(gòu)的主要組成

18、成分，在大腦、神經(jīng)組織、骨髓和肝臟等含量較多,常用顯示方法有酸性蘇木素法和吡啶提取法,神經(jīng)組織主要由磷脂和糖脂構(gòu)成，用此法可以顯示磷脂，用PAS顯示糖脂,糖原染色,糖原又名肝糖，以大小不等的顆粒貯存于肝細(xì)胞及肌細(xì)胞漿中，遇碘變褐色，易溶于水機(jī)體壞死后，糖原即被破壞，須取新鮮標(biāo)本并及時(shí)固定,碘酸-Schiff氏法（PAS）,能打開多糖類結(jié)構(gòu)的乙二醇基（-CHOH-CHOH-）或氨羥基（-CHOH-CHNH2-）的碳鍵，生成醛基化合物，暴

19、露出游離醛基（-CHO）。再與無色品紅液作用，生成新的紅色或紫紅色復(fù)合物，即Schiff反應(yīng)。糖原被染成紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色,該方法對(duì)含乙二醇基或氨羥基的多糖呈陽(yáng)性反應(yīng)急性心肌缺血時(shí)心肌糖原消失，饑餓時(shí)肝糖原減少，糖尿病時(shí)肝、腎、腎曲小管可出現(xiàn)大量糖原,色素染色,含鐵血黃素染色,鑒別組織或細(xì)胞中的黃棕色色素性質(zhì),黑色素染色,含黑色素的組織切片在HE染色中容易與含鐵血黃素、脂褐素等混淆,脂褐素染色,在老年性萎縮和惡液質(zhì)患者的實(shí)質(zhì)細(xì)胞、病毒

20、性肝炎時(shí)星形細(xì)胞內(nèi)有脂褐素出現(xiàn),膽色素染色,化學(xué)成分是膽紅素和橙色血質(zhì)，為不含鐵的血紅蛋白分解產(chǎn)物,鈣鹽染色,病理性鈣化是常見病理變化,神經(jīng)組織染色,尼氏體染,緩沖亞甲藍(lán)法（Pischingert法）、混合染色法（焦油紫、硫堇、亞甲藍(lán)、甲苯胺藍(lán)法）、Thionine氏硫堇法、甲苯胺藍(lán)法、焦油紫法、培花青法等,尼氏體的存在或消失是神經(jīng)細(xì)胞是否受損的重要指標(biāo)。腦缺血、腦炎、脊髓前角灰質(zhì)炎及軸突反應(yīng)等病變時(shí)，神經(jīng)元受損，尼氏體可溶解消失,神經(jīng)

21、軸突染色,軸突有嗜銀性，常用銀浸鍍法、甘氨酸銀浸鍍法和Holmes氏法染色,周圍神經(jīng)干病變可用此法了解神經(jīng)纖維破壞程度及范圍，如麻風(fēng)病、維生素B1缺乏癥或一些中毒性周圍神經(jīng)疾病等,神經(jīng)髓鞘染色,髓鞘（myelin）是包裹在神經(jīng)軸突外面的節(jié)段性管狀鞘，是由雪旺氏細(xì)胞的胞膜（周圍神經(jīng)纖維）或少突膠質(zhì)細(xì)胞的胞膜（中樞神經(jīng)纖維）包卷軸突作螺旋狀盤繞。髓鞘由鞘磷脂構(gòu)成，含60%的類脂質(zhì)和40%的蛋白質(zhì),碳酸鋰蘇木素法、砂羅鉻花青法、四氧化鋨法、W

22、eil氏鐵明礬蘇木素法、Weigert鐵蘇木素法、Kultsohitsky酸性蘇木素鋨酸法、Luxol氏堅(jiān)牢藍(lán)甲苯酚紫法和Marchi氏鋨酸法等。,神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞染色,氯化金升汞法、PTAH法、Holzer氏磷鉬酸結(jié)晶紫法、Scharenberg氏法、Rio-Hortega氏法等，均屬鍍金法，在加入二氯化汞的氯化金溶液中，星形膠質(zhì)細(xì)胞具有嗜金性。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤與腦膜瘤、室管膜瘤等鑒別時(shí)往往需要做膠質(zhì)細(xì)胞染色,核酸及核蛋白染色體染色,Fe

23、ulgen氏染色,顯示DNA的一種常用方法?；驹硎窃谒崴庀?，去除DNA中的嘌呤，暴露出脫氧核糖核酸的醛基，后者再與Schiff氏試劑反應(yīng)，生成紫紅色產(chǎn)物，用顯微分光光度計(jì)和流式細(xì)胞測(cè)量計(jì)對(duì)細(xì)胞分別進(jìn)行靜態(tài)DNA測(cè)量和流式細(xì)胞測(cè)量,核仁組成區(qū)（NORS）蛋白染色,是rRNA的染色體片段，與嗜銀酸性非組蛋白有關(guān)。rRNA基因直接控制著核糖體和蛋白質(zhì)的合成。計(jì)數(shù)細(xì)胞內(nèi)NORS的數(shù)量可反映細(xì)胞增殖的情況。經(jīng)典方法是銀染法，如PLOTON改

24、良法，鏡下NORS位于細(xì)胞核內(nèi)呈黑色的顆粒狀,病理內(nèi)源性沉著物染色,纖維素染色,甲基紫、MSB和PAS等染色法。炎癥滲出性改變、DIC、高血壓的小血管壁及一些膠原性疾病的疏松纖維,淀粉樣物質(zhì)染色,剛果紅染色法（淀粉樣物質(zhì)呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色）和甲基紫染色法（淀粉樣物質(zhì)呈紅色或紫紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色）。可用于輔助診斷全身消耗性疾病、區(qū)分淀粉樣變性與其他變性、腫瘤的診斷與鑒別等,病原微生物染色,真菌染色,細(xì)菌染色,螺旋體染色,病毒包涵體染

25、色,原位蛋白質(zhì)檢測(cè),定位定性定量,免疫組織化學(xué),酶組織化學(xué),immunohistochemistry，IHC,enzymohistochemistry，EHC,免疫組織化學(xué),以抗原－抗體反應(yīng)為理論基礎(chǔ)以化學(xué)方法顯示抗原－抗體反應(yīng)結(jié)果定位、定性或定量檢測(cè)組織和細(xì)胞內(nèi)特定抗原或抗體,免疫組織化學(xué)與免疫細(xì)胞化學(xué)本質(zhì)上一致，習(xí)慣上共同稱為免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IHC），也可稱為原位免疫學(xué)（in situ

26、 immunology）,IHC的基本知識(shí),抗原,由抗原分子表面的抗原決定簇（antigenic determinant）決定其免疫原性，也是抗原與抗體特異結(jié)合的基本單位，也稱抗原表位（epitope）,抗體,多克隆抗體（polyclonal antibody, pAb）,單克隆抗體（monoclonal antibody,mAb）,基因工程抗體,多克隆抗體（polyclonal antibody, pAb）,又叫血清抗體，機(jī)體接受抗原

27、主動(dòng)或被動(dòng)免疫后，從血清中分離提純的抗體。pAb由多個(gè)B細(xì)胞克隆針對(duì)不同的抗原決定簇而產(chǎn)生，特異性較低，與其他抗原間存在交叉反應(yīng)，使背景著色較高。各批次間可能存在特異性和親和性的差別。pAb制備程序簡(jiǎn)單，易大量獲得，成本較低，在一些特異性要求不高的實(shí)驗(yàn)中，仍在廣泛應(yīng)用。,單克隆抗體（monoclonal antibody,mAb）,Milstein & kÖhler，1975原理：抗原免疫小鼠，將小鼠脾臟淋巴細(xì)胞

28、與體外培養(yǎng)的人骨髓瘤細(xì)胞株在一定條件下融合，形成可長(zhǎng)期存活并能分泌抗體的雜交瘤（hybridoma）細(xì)胞，將其分離培養(yǎng)后形成單個(gè)瘤細(xì)胞克隆。培養(yǎng)上清或?qū)㈦s交瘤細(xì)胞注入裸鼠腹腔產(chǎn)生的腹水中就含有瘤細(xì)胞分泌的抗體，這就是mAbmAb由一個(gè)瘤細(xì)胞克隆產(chǎn)生，只針對(duì)一個(gè)抗原決定簇，所有抗體分子在結(jié)構(gòu)上完全一致，具有高度特異性和穩(wěn)定性,基因工程抗體,采用DNA重組技術(shù)生產(chǎn)的抗體－第3代抗體1989年Huse等首次構(gòu)建抗體基因庫(kù)，使抗體研究從體內(nèi)

29、和細(xì)胞水平進(jìn)入到分子水平基因工程抗體包括嵌合抗體、人源性型抗體、完全人源化抗體、單鏈抗體、雙功能抗體、片段抗體等重組抗體的體積越來越小，或被重新構(gòu)建成多價(jià)分子，或與其它分子融合，如放射性核素、毒素、酶、脂質(zhì)體和病毒等重組技術(shù)的出現(xiàn)使抗體改造成為可能，并取代雜交瘤技術(shù)，為以抗體為基礎(chǔ)的生物藥物研發(fā)開拓了廣闊前景,抗體標(biāo)記,Ag-Ab復(fù)合物并不可見，必須將抗體加以標(biāo)記并利用標(biāo)記物與其他物質(zhì)的反應(yīng)，形成可見的發(fā)光或顯色,能與抗體形成牢固

30、的共價(jià)鍵結(jié)合；不影響抗原抗體結(jié)合；具有信號(hào)放大效應(yīng)；發(fā)光或顯色反應(yīng)要發(fā)生在抗原－抗體結(jié)合原位與周圍有較高對(duì)比度,熒光標(biāo)記物,黃色結(jié)晶粉末明亮的黃綠色熒光,FITC,紫紅色粉末橙紅色熒光,TMRITC,兩種標(biāo)記物顏色對(duì)比鮮明，可用于雙重標(biāo)記熒光染色。,酶標(biāo)記物,免疫酶組織化學(xué)法：用酶蛋白標(biāo)記抗體。通過免疫反應(yīng)后追加標(biāo)記物酶催化底物的組織化學(xué)反應(yīng)，得到具有一定電子密度的有色產(chǎn)物，可用光學(xué)及電子顯微鏡觀察。,酶活性高而穩(wěn)定終產(chǎn)物

31、穩(wěn)定不擴(kuò)散酶與抗體結(jié)合不影響Ag-Ab特異性反應(yīng)組織與體液中不存在內(nèi)源性酶及其底物,酶標(biāo)記物,辣根過氧化物酶(HRP),(1)體積小，不會(huì)遮蓋抗原的結(jié)合部位，穿透力強(qiáng)(2)穩(wěn)定且易獲得高純度酶制品(3)具較高活性及特異性(4)不溶性好，終產(chǎn)物不向周邊擴(kuò)散(5)內(nèi)源性酶較少，抑制方法較多(6)價(jià)格相對(duì)較便宜(7)特異性底物是過氧化氫(H202)，可選用不同發(fā)色基團(tuán)（電子供體），使終產(chǎn)物呈不同顏色,HRP+H2O2→HRP.

32、H2O2HRP.H2O2+DH2→HRP+D+2H2O,DAB是廣泛應(yīng)用的電子供體，產(chǎn)物為棕黃色顆粒，不溶于水和有機(jī)溶劑 有潛在致癌性,堿性磷酸酶(AKP),酶標(biāo)記物,磷酸萘酯＋H2O→α－萘酚＋磷酸鹽α－萘酚＋偶氮染料→有色沉淀,分子大（100kDa），穿透力較弱某些組織細(xì)胞內(nèi)含有較高的內(nèi)源性AKP，干擾染色,不溶于有機(jī)溶劑，切片不易褪色呈色反應(yīng)的敏感性比HRP高2-3倍，顯色時(shí)間從30min到48h其產(chǎn)物為鮮紅色，可與H

33、RP組合進(jìn)行IHC的雙重或多重標(biāo)記,缺點(diǎn),優(yōu)點(diǎn),葡萄糖氧化酶（glucoseoxdase，GOD）,其他標(biāo)記物,膠體金和鐵蛋白：免疫電鏡技術(shù)的主要標(biāo)記物,棗紅蛋白與FITC共同用于雙重標(biāo)記,親和組織化學(xué)標(biāo)記物,抗體標(biāo)記,利用具有親和特性的物質(zhì)對(duì)間的高度親和性，將酶、熒光等標(biāo)記物與親和物質(zhì)連接，對(duì)抗原或其他靶物質(zhì)進(jìn)行定位和定量的方法,生物素-親和素激素-受體植物凝集素-糖類葡萄球菌A-IgG Fc片段,生物素－親和素系統(tǒng),生物素（b

34、iotin）－vitamin H親和素（avidin）－卵白素或抗生物素蛋白（antibiotin），由4個(gè)相同亞基組成，1分子親和素可結(jié)合4分子生物素二者以非共價(jià)鍵不可逆結(jié)合，其親和力是抗原－抗體親和力的100萬(wàn)倍，是自然界已知結(jié)合最緊密的物質(zhì)對(duì)之一,生物素分子量小，1分子抗體可結(jié)合約150個(gè)生物素不影響抗體與抗原結(jié)合，也不影響與之結(jié)合的酶活性親和素可與熒光素、酶等標(biāo)記物偶聯(lián)具有敏感性高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好和方便快速等特點(diǎn)

35、以不與內(nèi)源性生物素結(jié)合的鏈霉親和素來代替親和素,,Conjugated avidin,常用抗體標(biāo)記技術(shù)比較,IHC主要染色方法及原理,5S：specificitysensitivitysimplicitysafelysave,直接法間接法PAP法APAAP法ABC法 ——,直接法（direct method）,用熒光素或酶標(biāo)記的特異性抗體，直接與待檢組織中的抗原反應(yīng)，又稱一步法,操作簡(jiǎn)單，特異性高而敏感性低抗體需

36、單獨(dú)標(biāo)記，生產(chǎn)成本高最常用于腎活檢組織及結(jié)締組織病皮膚活檢標(biāo)本的IgG、IgA、IgM及補(bǔ)體等免疫相關(guān)蛋白的檢測(cè)也用于FCM測(cè)定各種細(xì)胞表面抗原,間接法（indirect method）,又稱夾心法（sandwich method），分兩步檢測(cè)抗原或抗體。檢測(cè)抗原時(shí)，先以未標(biāo)記的特異性抗體（第一抗體）與組織或細(xì)胞中的抗原反應(yīng)，洗去未結(jié)合的抗體后，再以酶或熒光素標(biāo)記的第二抗體（抗抗體）與第一抗體結(jié)合，再顯色或熒光檢查。,敏感性是直接法

37、的3-5倍，但特異性有所降低最大優(yōu)點(diǎn)在于不必標(biāo)記每種第一抗體，只需要標(biāo)記數(shù)量有限的第二抗體，利于商品化生產(chǎn),非標(biāo)記抗體法,抗體與酶或熒光素結(jié)合不可避免地會(huì)降低抗體與抗原結(jié)合能力，并影響標(biāo)記物本身活性,酶橋法（enzyme bridge technique）,PAP法（peroxidase antiperoxidase method）,APAAP法,親和素-生物素法,親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物技術(shù)（avidin biotin- p

38、eroxidase complex technique，ABC）,ABC復(fù)合物由親和素與酶標(biāo)生物素以一定比例結(jié)合而成，親和素作為橋梁，將ABC復(fù)合物與生物素化的抗體結(jié)合起來，再由抗體檢出抗原,最大優(yōu)點(diǎn)是敏感性高，背景干凈，是目前應(yīng)用最為廣泛的免疫組化方法,親和素-生物素法,酶標(biāo)親和素－生物素技術(shù)（labeled avidin-biotin technique，BA或LAB技術(shù)）,用親和素分子直接與酶分子結(jié)合，形成酶－親和素復(fù)合物，再與生

39、物素標(biāo)記的二抗結(jié)合，其敏感性較ABC法又有數(shù)倍提高。如用鏈霉親和素（streptavidin, SA）代替親和素，又衍生出LsAB法，該法避免了與切片中內(nèi)源性生物素結(jié)合，特異性更高。,EnVision法,利用線狀葡聚糖分子與大量酶結(jié)合，再將葡聚糖－酶復(fù)合物(EnVision復(fù)合物)連接到二抗上，形成酶－葡聚糖－二抗復(fù)合物，復(fù)合物中酶分子絕對(duì)數(shù)量遠(yuǎn)高于其他復(fù)合物（可達(dá)150個(gè)）；同時(shí)存在多個(gè)第二抗體（15個(gè)），增加了該復(fù)合物與特異性抗體的

40、結(jié)合機(jī)會(huì)，具高度放大作用。,催化放大系統(tǒng)（catalyzed signal amplication, CSA法）,原理是增加了生物素化的酪胺基團(tuán)分子，通過HRP的催化作用，使酪胺基團(tuán)分子與抗原抗體結(jié)合部位形成一個(gè)共價(jià)結(jié)合位點(diǎn)，使大量生物素沉積在信號(hào)位點(diǎn)上，當(dāng)再次滴加鏈霉親和素－HRP復(fù)合物時(shí)，原始信號(hào)得到幾何級(jí)放大。,常用IHC方法比較,IHC主要方法演進(jìn)示意圖,酶組織化學(xué)技術(shù),酶（enzyme）－生物體內(nèi)催化各種化學(xué)反應(yīng)和新陳代謝的特

41、殊蛋白質(zhì),組織細(xì)胞內(nèi)的酶并不直觀可見，但酶可催化特定底物產(chǎn)生相應(yīng)反應(yīng)產(chǎn)物，通過檢測(cè)產(chǎn)物即可在酶所在部位獲得相應(yīng)信號(hào)。這種通過酶的作用形成反應(yīng)產(chǎn)物，經(jīng)捕捉反應(yīng)產(chǎn)物信號(hào)來顯示細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)中的各種酶，對(duì)其進(jìn)行定性、定位和定量分析的方法稱為酶組織化學(xué)技術(shù),1950s廣泛應(yīng)用于病理學(xué)，操作復(fù)雜，必需新鮮組織以保持酶活性,反應(yīng)特異性較低，限制了其應(yīng)用,酶本身為蛋白質(zhì)，具有抗原性，可用IHC檢測(cè),酶組織化學(xué)技術(shù),金屬沉淀法,底物經(jīng)酶分解后，其產(chǎn)物可

42、與大多數(shù)金屬結(jié)合，如金、銀、銅、鐵、鉛、鈷及其化合物，產(chǎn)物呈特定顏色,偶聯(lián)偶氮法,基本原理是應(yīng)用特定人工合成底物進(jìn)行酶促反應(yīng)，其分解產(chǎn)物再與重氮鹽結(jié)合，引起偶聯(lián)偶氮反應(yīng)，形成不溶性偶氮色素,色素形成法,無色底物經(jīng)酶促反應(yīng)，在局部形成色素沉著對(duì)酶定位,酶組織化學(xué)技術(shù),堿性磷酸酶,酸性磷酸酶,三磷酸腺苷酶,琥珀酸脫氫酶,過氧化物酶,過氧化氫酶,膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶,常用酶組織染色法檢測(cè)的酶,原位核酸檢測(cè),核酸分子雜交（nucleic acid m

43、olecular hybridization）是檢測(cè)核酸分子間序列同源性的一種技術(shù)。原理：核酸間的堿基互補(bǔ)結(jié)合，及DNA高溫變性低溫復(fù)性不同來源單鏈核酸只要彼此間存在互補(bǔ)順序，就可復(fù)性形成雜交體。鏈間序列互補(bǔ)程度越高，越容易結(jié)合形成雜交體結(jié)構(gòu)且更加牢固不易洗脫。,原位核酸檢測(cè),常用技術(shù),,原位雜交（ISH）,熒光原位雜交（FISH）,原位PCR,引物介導(dǎo)的原位標(biāo)記技術(shù)（PRINS）,原位雜交：in situ hybridizatio

44、n,1969年由Pardue和John等人在不同的實(shí)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r(shí)建立,應(yīng)用已知堿基順序并帶有標(biāo)記物的探針（probe），與待檢標(biāo)本上的核酸特異性結(jié)合形成雜交體，再用與標(biāo)記物相對(duì)應(yīng)的檢測(cè)系統(tǒng)，在被檢測(cè)的核酸原位形成帶顏色的雜交信號(hào)，用顯微鏡或電子顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位。,組織切片預(yù)處理,探針制備,最大限度地保持細(xì)胞內(nèi)DNA或RNA的完整性,組織具有良好的通透性,探針的標(biāo)記,放射性標(biāo)記,,優(yōu)點(diǎn)：敏感性和特異性均較高,缺點(diǎn)：有放射污染、成本高、

45、實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng),3H，35S，32P，14C和125I等,非放射性標(biāo)記,熒光素,優(yōu)點(diǎn)是耗時(shí)短，操作簡(jiǎn)便，干擾因素少，多用于新鮮或冷凍組織、細(xì)胞和染色體的原位檢測(cè)缺點(diǎn)是探針成本較高，需熒光顯微鏡觀察并及時(shí)采圖熒光素本身為半抗原，可經(jīng)抗體檢出,探針的標(biāo)記,非放射性標(biāo)記,生物素（biotin）,地高辛（digoxin）,人類和動(dòng)物組織中均無類似物，特異性極高作為半抗原，地高辛也可由抗地高辛抗體檢出已成為目前應(yīng)用最廣泛的非放射性標(biāo)記物,雜

46、交,雜交后清洗,雜交體檢測(cè),去除非特異信號(hào)，減少背景著色，以獲得較高信/噪比（signal/noise）,標(biāo)記探針和待檢樣品上的靶序列通過堿基互補(bǔ)配對(duì)相結(jié)合而形成雜交體的過程,放射自顯影,熒光顯微鏡,免疫組織化學(xué)技術(shù),ISH的應(yīng)用,定位細(xì)胞內(nèi)特異性mRNA的轉(zhuǎn)錄，用于基因圖譜、基因表達(dá)和基因組進(jìn)化的研究；感染組織中病毒DNA/RNA的檢測(cè)和定位；癌基因、抑癌基因及各種功能基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)及其變化；基因在染色體上的定位；染色體

47、變化，如數(shù)量異常和染色體易位等；間期細(xì)胞遺傳學(xué)研究，如遺傳病的產(chǎn)前診斷和某些遺傳病基因攜帶者的確定某些腫瘤的診斷和生物學(xué)劑量測(cè)定,熒光原位雜交－FISH,1986年由Dilla首次建立,用熒光物質(zhì)標(biāo)記DNA探針，通過ISH檢測(cè)靶DNA,FISH常為DNA-DNA雜交,FISH的探針,重復(fù)序列探針（repeat sequence probes）位點(diǎn)特異性探針（one locus specific identifier probe，L

48、SI ）染色體探針（Chromosome painting probes）單一序列探針（Single sequence probes）由其它載體攜帶的小片段DNA探針 （small fragments of DNA inserted in other carriers）,將已知堿基序列的特異DNA片段作為探針，標(biāo)記上不同熒光素，與靶核酸進(jìn)行DNA-DNA原位雜交，可在熒光顯微鏡下直接觀察結(jié)果,直接法FISH,優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單、快速。

49、,缺點(diǎn)是信號(hào)較弱，敏感性較低,間接法FISH,探針常用生物素或地高辛等非熒光素標(biāo)記雜交后通過親和連接或免疫反應(yīng)，帶入各種發(fā)光物質(zhì)來檢測(cè)雜交體的存在對(duì)雜交信號(hào)有逐級(jí)放大作用，從而增加了雜交的敏感性,FISH的應(yīng)用,基因進(jìn)化研究,繪制基因圖譜,染色體數(shù)量和形態(tài)結(jié)構(gòu)異常,腫瘤細(xì)胞遺傳學(xué)研究,比較基因組雜交（CGH）,原位PCR,原位PCR技術(shù)的基本原理是PCR和ISH技術(shù)的結(jié)合先在組織切片上進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增待檢基因，再與擴(kuò)增后的DNA

50、原位雜交,固定細(xì)胞和組織酶消化處理，提高細(xì)胞通透性，充分暴露核酸于PCR反應(yīng)體系中在原位PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)結(jié)果檢出,原位PCR大致操作流程：,原位PCR的分類,根據(jù)dNTP或引物標(biāo)記與否,直接法,間接法,根據(jù)標(biāo)記物性質(zhì)和擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)方法,原位反轉(zhuǎn)錄PCR,原位再生式序列復(fù)制反應(yīng),直接法原位PCR,應(yīng)用標(biāo)記的dNTP或引物，對(duì)樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，標(biāo)記分子就摻入到擴(kuò)增產(chǎn)物中，擴(kuò)增產(chǎn)物可直接觀察而不需再進(jìn)行原位雜交,優(yōu)點(diǎn)是擴(kuò)增產(chǎn)物直接

51、攜帶標(biāo)記分子，實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)便省時(shí)擴(kuò)增效率較低特異性較差，易出現(xiàn)假陽(yáng)性當(dāng)對(duì)dNTP進(jìn)行標(biāo)記時(shí)，dNTP可能因?yàn)榉前蠨NA自身修復(fù)而摻入到其中，成為非特異信號(hào)引物和模板的錯(cuò)配也常導(dǎo)致假陽(yáng)性,間接法原位PCR,先將引物、核苷酸及酶等反應(yīng)物加入細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增（PCR），再用特異標(biāo)記探針與擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行原位雜交（ISH）,優(yōu)點(diǎn)是克服了直接法導(dǎo)致的非特異信號(hào)，提高了擴(kuò)增效率和反應(yīng)的特異性，成為目前應(yīng)用最廣的原位PCR技術(shù)缺點(diǎn)是該方法為原位PCR和

52、ISH技術(shù)的結(jié)合，操作復(fù)雜，耗時(shí)較長(zhǎng)；也存在著引物錯(cuò)配可能產(chǎn)生非特異性信號(hào)的問題。但因不需標(biāo)記dNTP，非特異性信號(hào)低于直接法原位PCR,原位反轉(zhuǎn)錄PCR,將反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR結(jié)合，用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)低拷貝mRNA反應(yīng)先以mRNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA再以該cDNA為模板進(jìn)行PCR標(biāo)本需經(jīng)DNA酶預(yù)處理去除細(xì)胞內(nèi)的DNA，以保證PCR所擴(kuò)增的模板cDNA是mRNA的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,原位再生序列復(fù)制反應(yīng)(self-sustaine

53、d sequence replication reaction),以mRNA為模板，通過逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶和RNA酶的作用，以RNA/cDNA和雙鏈cDNA為中間體，直接擴(kuò)增RNA靶序列擴(kuò)增反應(yīng)在42℃下進(jìn)行兩小時(shí)，不需要熱循環(huán)該法為檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)低拷貝數(shù)mRNA提供了一個(gè)新方法因擴(kuò)增反應(yīng)在較低溫度下進(jìn)行，組織抗原保存較好，便于和IHC相結(jié)合,原位PCR的不足,①特異性不高，特別是假陽(yáng)性不可避免,②技術(shù)操作復(fù)雜，影響因素多,③需要