2016分子腫瘤概論研究生學(xué)生

1、,,,分子腫瘤概論 重慶醫(yī)科大學(xué)病理教研室 王婭蘭 教授(博士生導(dǎo)師),,分子腫瘤概論一、有關(guān)腫瘤的基本概念（復(fù)習(xí)）腫瘤（tumor, neoplasm) 基因水平 調(diào)控失常 異常增生 新生物腫瘤生物學(xué)行為----浸潤、轉(zhuǎn)移能力 浸潤 (invasion)：起源處遷移

2、 侵入周圍鄰近組織,,轉(zhuǎn)移(metastasis)：從原發(fā)部位血管、淋巴管、體腔它處繼續(xù)生長與原發(fā)瘤同樣類型腫瘤 （轉(zhuǎn)移瘤或繼發(fā)瘤）,轉(zhuǎn)移的途徑,（2）Hematogenenous metastasis 全身臟器（3）Transcoelomic metastasis 體腔內(nèi)臟器----脫落種植 （醫(yī)源性種植） 浸潤生長---惡性腫瘤生長的特點(diǎn)

3、 腫瘤轉(zhuǎn)移過程必經(jīng)的第一步,,腫瘤的組織結(jié)構(gòu) 實(shí)質(zhì) （parenchyma)間質(zhì) （mesenchyma, stroma) 腫瘤間質(zhì)的主要成分1. 血管 小血管 毛細(xì)血管 血竇樣 血管球樣,,新的腫瘤血供模式---血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry，VM)1999年，美國學(xué)者M(jìn)aniotis等一種完全不同于經(jīng)典血管生成的微循環(huán)模式---小管狀（似血管）---管壁主要由

4、基底膜(PAS陽性)圍成，外襯以腫瘤細(xì)胞---腔內(nèi)有血漿和紅細(xì)胞流動(dòng)---管道與內(nèi)皮性血管相通多存在于高度惡性腫瘤,,血管生成擬態(tài)（vasculogenic mimicry） 腫瘤細(xì)胞構(gòu)成 有基底膜 小管狀（似血管） 與血管交通,2. 結(jié)締組織間質(zhì) （1）纖維和基質(zhì) 膠原纖維 常規(guī) HE ---- 紅 特殊化學(xué)染色

5、 VG 改良法---- 紅 Masson---- 蘭色 構(gòu)成成分 I II III型膠原原纖維 又由相應(yīng)原纖維分子構(gòu)成 免疫組化或分子生物學(xué)方法可區(qū)別,,,,彈力纖維 常規(guī) HE---淡紅色 特殊化學(xué)染色 Weigert或Verhceff---暗蘭或黑色，彈力 酶消化

6、后陰性,,網(wǎng)狀纖維 銀染---黑色，故也稱嗜銀纖維。 PAS ---強(qiáng)陽性,,成分 膠原蛋白為主要成分 細(xì)胞間質(zhì)網(wǎng)狀纖維--- Ⅲ型膠原蛋白 基底膜網(wǎng)狀纖維--- Ⅳ型膠原蛋白和 層黏連蛋白（laminin）,,纖維黏連蛋白 Fibronectin（FN） 作用 A. 連接基質(zhì)中各種成分 B. 介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)成分與細(xì)胞表面連接黏蛋白 又稱蛋白多糖（p

7、roteoglycan） 如透明質(zhì)酸，硫酸肝素等 骨黏素 （osteonectin）,,（2）基底膜 (basement membrane , BM) 多種成分 與疾病（腫瘤浸潤）關(guān)系密切 Ⅳ 型膠原 ---不形成纖維，與Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 型膠原不同 層黏連蛋白 （laminin ,LM） ---有與細(xì)胞膜LM 受體相結(jié)合的位點(diǎn),,（3）細(xì)胞成分 固有的細(xì)胞成分 ---纖維母細(xì)胞和纖維細(xì)胞

8、---肌纖維母細(xì)胞 ---間充質(zhì)細(xì)胞 ---巨噬細(xì)胞---樹突狀細(xì)胞,,反應(yīng)性細(xì)胞成分 各種細(xì)胞浸潤 --- 淋巴細(xì)胞 最常見 ---漿細(xì)胞 ---巨噬細(xì)胞 都屬免疫活性細(xì)胞,,二、腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制（一）腫瘤細(xì)胞的浸潤轉(zhuǎn)移 1.腫瘤細(xì)胞增殖和擴(kuò)展 浸潤轉(zhuǎn)移的前提和基礎(chǔ) 2.腫瘤血管生成(tumor angiogen

9、esis) 腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移的必要條件,,3.腫瘤細(xì)胞分離脫落，與細(xì)胞外基質(zhì)黏附 （1）瘤細(xì)胞表面負(fù)電荷增加 （2）瘤細(xì)胞黏附力的改變 ①瘤細(xì)胞自身結(jié)構(gòu)異常 ②瘤細(xì)胞同質(zhì)黏附力下降 指同種瘤細(xì)胞之間的黏附力,③瘤細(xì)胞異質(zhì)黏附力增加 指腫瘤細(xì)胞與其它不同細(xì)胞及間質(zhì)的黏附力同質(zhì)黏附力降低，有利于腫瘤細(xì)胞分離；異質(zhì)黏附力的增加，有利于瘤細(xì)胞與基底膜、間質(zhì)成分粘附并穿過這些組織均

10、由黏附分子介導(dǎo)通過配-受體之間的識別和結(jié)合實(shí)現(xiàn),,（3）腫瘤黏附分子(adhesion molecules) 細(xì)胞表面結(jié)構(gòu) ① 鈣黏蛋白(cadherin) 又稱為鈣連接素，鈣黏素。 依賴細(xì)胞外鈣 介導(dǎo)鈣離子依賴性細(xì)胞與細(xì)胞（同源細(xì)胞）的黏附 據(jù)分布不同 E-鈣黏蛋白 P-鈣黏蛋白 N-鈣黏蛋白

11、 H-cad,,②整合素(integrin)---細(xì)胞表面糖蛋白 ，約有20 多個(gè)亞型 ---各種腫瘤細(xì)胞表面整合素種類不同---腫瘤生長各個(gè)階段表達(dá)水平也不同 作用 a.介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附 b.參與不同細(xì)胞之間的黏附連接 C.扮演細(xì)胞信號傳遞的角色配體-整合素-細(xì)胞骨架蛋白跨膜信息傳導(dǎo)系統(tǒng),,③ 免疫球蛋白超基因家族(immunoglobulin superfamily) 主要參與細(xì)胞

12、與細(xì)胞間的連接 ICAM-1 （細(xì)胞間黏附分子-1） VCAM-1 （血管黏附因子） NCAM （神經(jīng)細(xì)胞黏附因子） 其它 包括CEA 、DCC,,④選擇素(selectin) 內(nèi)源性植物凝血素（凝集素） 作用 介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞、血小板與瘤細(xì)胞黏附 選擇素家族包括： P-selectin E-selectin L-selectin,,⑤ CD44 及其它 CD 44(

13、透明質(zhì)酸受體) ---介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)粘附 路易斯寡糖（SLEX，,s-LewisX ） ---血管內(nèi)皮細(xì)胞E-選擇素的配體,,4.瘤細(xì)胞的遷移(migration)及化學(xué)趨向性 (1)瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng) 黏附；肌動(dòng)蛋白、微管、中間絲 (2)瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié),,據(jù)其作用，大致可分為兩大類：僅影響運(yùn)動(dòng)的因子 遷移刺激因子（MSF）既影響運(yùn)動(dòng)又影響生長的因子 AMF (自分

14、泌運(yùn)動(dòng)因子) HGF/SF（肝細(xì)胞生長因子/分散因子),,(3)瘤細(xì)胞的化學(xué)趨向性 21KD 的蛋白質(zhì) 骨吸收因子,,5.細(xì)胞外基質(zhì)的降解(1)腫瘤浸潤細(xì)胞外基質(zhì)的步驟 Liotta 1986年提出 第一步 黏附于基底膜或其他間質(zhì)成分 第二步 分泌蛋白酶并激活, 降解瘤細(xì)胞 鄰近的細(xì)胞外基質(zhì) 第三步 進(jìn)入受蛋白酶降解的基質(zhì)區(qū)域內(nèi),,(2)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的

15、蛋白水解酶①絲氨酸蛋白酶類及其抑制因子纖維蛋白溶解酶(纖溶酶) 纖溶酶原 a. 降解基質(zhì) 如纖維蛋白，F(xiàn)N, LM, 蛋白多糖 b. 激活膠原酶 膠原降解,,尿激酶型纖溶酶原激活劑(urokinase-type plasminogen activator , u-PA）系統(tǒng) A．u-PA： 介導(dǎo)細(xì)胞周圍基質(zhì)蛋白的降解B．u-PA 受體（u-PAR）及纖溶酶原受體

16、 活化u-PA 原酶形式的u-PA纖溶酶原+纖溶酶原受體 纖溶酶,,,,,,C．PAI （PA 抑制劑） PAI1 是u-PA 的主要抑制劑 PAI2 不同腫瘤表達(dá)意義不一 PAI3 功能不清,,②基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMP）及其

17、抑制因子 需鈣、鋅離子作輔助因子 MMP 分類 膠原酶：如間質(zhì)膠原酶 （Collagenase） 明膠酶：如明膠酶A (gelatinase A) 間質(zhì)溶素：如間質(zhì)溶素1 、2 膜型基質(zhì)金屬蛋白酶：Ⅰ、Ⅱ型,,可分別降解ECM中各種不同成分 ECM降解的主要蛋白水解酶類金屬蛋白酶抑制物 TIMP-1 ，TIMP-

18、2 浸潤與否取決于MMP與TIMP的對比 MMP>>TIMP ECM降解才能成為可能,,③胱氨酸蛋白酶類 Cathepsin B 作用 降解ECM中各種膠原、LM、 FN、黏蛋白 激活間質(zhì)膠原酶和IV型膠原酶④天（門）冬氨酸蛋白酶 cathepsin D, E 在腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移中的作用 CD 表達(dá)的調(diào)節(jié),,6.瘤細(xì)胞以主動(dòng)方式入循環(huán)管道并形成栓子

19、微小淋巴管、微小靜脈壁 縫隙 血管 基底膜缺損 瘤細(xì)胞存在形式 單個(gè) 成團(tuán) 同類癌栓 異類癌栓 黏附分子對其發(fā)揮調(diào)節(jié)作用,,7.在特定器官的毛細(xì)血管滯留并黏著，再次穿過血管壁并定居、增殖 器官特異性（選擇性）機(jī)制 (1) 黏附分子的作用 (2) 化學(xué)趨化因子（歸巢現(xiàn)象) (3) 微環(huán)境不適合

20、(4) 與免疫狀態(tài)有關(guān),,（二）機(jī)體免疫狀態(tài)與腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移 參與控制轉(zhuǎn)移的免疫細(xì)胞主要有 NK 細(xì)胞 巨噬細(xì)胞 T 淋巴細(xì)胞 （三）腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因 轉(zhuǎn)移相關(guān)基因指基因的表達(dá)和改變能夠促進(jìn)或?qū)е履[瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的基因,,（四）腫瘤表觀遺傳改變與腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移表觀遺傳學(xué)(Epigenetics) ---與遺傳學(xué)(genetic)相對應(yīng)的概念---表

21、型狀態(tài)改變，基因型不改變 ---沒有DNA序列變化的情況下， 可遺傳的基因表達(dá)改變，導(dǎo)致的基因產(chǎn)物的變化。 ---1942年提出，上世紀(jì)80年代后期逐漸興起的一門新學(xué)科,,DNA的“后天性”修飾 CpG島高甲基化 癌細(xì)胞基因組低甲基化組蛋白殘基的各種修飾 磷酸化 乙?；?甲基化 泛素化等等,,（五）腫瘤干細(xì)胞(tumor stem cell, TSC) 2001年由Reya等提出 2006

22、年美國癌癥研究協(xié)會(huì)（AACR）定義 存在于腫瘤組織中具有無限自我更新能力并能產(chǎn)生不同分化程度的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞,,特征 (1) 無限增殖和多向分化 (2)存在自我更新的信號傳導(dǎo)途徑 (3)具不同表型，異質(zhì)性，對放化療不敏感 (4)具有端粒酶活性 (5)能轉(zhuǎn)移到各種不同的組織,,（六）腫瘤微環(huán)境與腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移 腫瘤細(xì)胞間質(zhì)細(xì)胞 細(xì)胞外基質(zhì)間質(zhì)細(xì)胞所分泌的活性介質(zhì)（細(xì)胞因子） 共同構(gòu)成的局部

23、內(nèi)環(huán)境,,微環(huán)境改變腫瘤細(xì)胞----自分泌和旁分泌 全身和局部組織-----代謝、分泌、免疫 結(jié)果： 限制或促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展,,,三.腫瘤學(xué)研究中常用的分子生物學(xué)基本技術(shù)及其應(yīng)用(一)蛋白表達(dá)異常的檢測---免疫組化（熒光）定位 ---ELISA和Western blot 、流式細(xì)胞術(shù)定量,,,,,抗體,細(xì)胞,,細(xì)胞,,細(xì)胞,,（二）蛋白質(zhì)相互作用的檢測方法1.酵母雙雜交法 驗(yàn)證兩個(gè)已知蛋白的相互作用

24、篩選與已知蛋白作用的未知蛋白酵母雙雜交系統(tǒng)是分析蛋白-蛋白間相互作用的有效和快速的方法，,,酵母雙雜交的原理是將2個(gè)目的蛋白分別與轉(zhuǎn)錄激活區(qū)（transcription activation domain，AD）和DNA 結(jié)合區(qū)（DNA-binding domain，DBD）融合產(chǎn)生新的融合蛋白，如果這2個(gè)目的蛋白能夠互相作用，則該相互作用會(huì)促使AD和DBD 互相靠近而產(chǎn)生有活性的轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而激活事先構(gòu)建到酵母基因組中的報(bào)告基因的轉(zhuǎn)

25、錄。（真核轉(zhuǎn)錄因子DBD能把蛋白定位到基因組特定DNA序列上，AD能夠使轉(zhuǎn)錄裝置激活基因轉(zhuǎn)錄。當(dāng)這兩個(gè)區(qū)域單獨(dú)存在時(shí)均沒有轉(zhuǎn)錄激活功能，但當(dāng)它們在空間上彼此聯(lián)系時(shí)，則能夠激活基因轉(zhuǎn)錄。）,,局限性 ⑴雙雜交系統(tǒng)分析蛋白間的相互作用定位于細(xì)胞核內(nèi) ⑵酵母雙雜交系統(tǒng)的一個(gè)重要的問題是“假陽性”,,2.免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CO-IP）是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的

26、常用、經(jīng)典方法。其基本原理是:細(xì)胞裂解液中加入抗體，與抗原形成特異免疫復(fù)合物，經(jīng)過洗脫，收集免疫復(fù)合物，然后進(jìn)行SDS-PAGE及Western blotting分析。,,缺點(diǎn)免疫沉淀蛋白有可能不是直接相互作用的蛋白，而是通過第三者間接相互作用的蛋白靈敏度不及蛋白親和色譜高必須在實(shí)驗(yàn)前預(yù)測目的蛋白是什么，以選擇最后檢測的抗體，若預(yù)測不正確，實(shí)驗(yàn)就得不到結(jié)果，方法本身具有冒險(xiǎn)性假陽性的概率比較高,,設(shè)置的對照包括：在對照組中

27、使用對照抗體，以缺失目的蛋白的細(xì)胞系作為陰性對照等等。,,3.GST沉淀實(shí)驗(yàn)（GST-pull down實(shí)驗(yàn)）主要是用來證明細(xì)胞外蛋白質(zhì)相互作用利用GST (Glutathione-S-transferase， GST)和谷胱甘肽親和樹脂之間的高親和性將GST固化在樹脂上GST和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶蛋白在細(xì)菌、動(dòng)物細(xì)胞等體系中融合表達(dá)固化的誘餌蛋白【即誘餌蛋白(Bait protein)】可以捕獲細(xì)胞裂解物中的互作用靶蛋白洗脫結(jié)合

28、物后通過western blot 檢測誘餌蛋白和靶蛋白,從而證實(shí)兩種蛋白間的相互作用或篩選相應(yīng)的目的蛋白,,,4.Far-Western blotting在經(jīng)典Far-Western印跡中，運(yùn)用經(jīng)標(biāo)記的或可被抗體檢測的“誘餌”蛋白檢測轉(zhuǎn)移膜上的“獵物”靶蛋白。用SDS-PAGE 或非變性PAGE分離含有未知靶蛋白的樣品（通常為細(xì)菌裂解液）然后轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后與已知誘餌蛋白孵育，運(yùn)用該誘餌蛋白的特異性檢測系統(tǒng)檢測。（出相應(yīng)條帶+）5.

29、生物信息學(xué),,（三）基因拷貝數(shù)、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA異常 ---- 核酸分子生物學(xué)方法進(jìn)行檢測核酸變性、復(fù)性基本性質(zhì)常用方法,,1. 核酸分子雜交（nucleic acid molecular hybridisation）技術(shù)最常用的基本技術(shù)基本原理： --標(biāo)記的已知堿基序列（DNA或RNA單鏈片段）（探針probe ） （同位素　P32 I125　 非同位素 生物素 地高辛 熒光素） --檢測

30、靶核酸（待測核酸）中是否存在與之 同源的序列,,（1）原位雜交 （ISH）（2）熒光原位雜交 （FISH），（3）雙色（多色）銀染原位雜交（DSISH）（4）Southern blot (DNA 雜交)（5）Northern blot (RNA 雜交),,,2. 聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction , PCR）技術(shù) 又稱體外基因擴(kuò)增利用DNA變性和復(fù)性原理體外進(jìn)行特定的DNA 片段

31、高效擴(kuò)增 獲得或放大特異基因信號的重要手段,,擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測 凝膠電泳分析 瓊脂糖凝膠電泳 (最常用) 聚丙烯酰胺凝膠電泳 單一條帶,,Real-time PCR RT-PCR3.基因芯片技術(shù),,(四)基因突變的檢測方法1.聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（Single strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain re

32、action products , PCR-SSCP）長度相同，構(gòu)象不同在非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳遷移率（泳動(dòng)率）不同堿基序列不同的單鏈DNA構(gòu)像改變,,基本方法 作PCR 將產(chǎn)物變性而成為單鏈 進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 顯示結(jié)果 可用同位素/熒光素標(biāo)記 非同位素標(biāo)記,,2.PCR-限制性片段長度多態(tài)性（restrection fragment length polymorphisms

33、, RFLP）分析技術(shù)基本原理 --序列中一個(gè)堿基發(fā)生改變 --使原來的內(nèi)切酶位點(diǎn)消失或產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn)--用限制性內(nèi)切酶消化PCR擴(kuò)增出來的DNA片段 --檢測其酶切片段長度的差異,,3.變性梯度凝膠電泳法（denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)基本原理 電泳時(shí)，不同濃度凝膠溫度不同 DNA鏈中有一個(gè)堿基改變

34、 在不同的溫度發(fā)生解鏈 電泳遷移率改變,,4. DNA 序列分析（DNA sequencing ） 5. 熒光原位雜交 ( FISH) 6． DNA 芯片技術(shù)（DNA chip ）,,（五）腫瘤的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性分析微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability , MI）, 是指簡單重復(fù)序列的增加或丟失 PCR + DNA 序列凝膠

35、電泳（六）腫瘤易感性檢測 采用相應(yīng)基因變異方法進(jìn)行檢測（七）腫瘤相關(guān)病毒 核酸雜交技術(shù)與PCR技術(shù) (八) 基因重組技術(shù) 主要目的是獲得某一基因或DNA片段的大 量拷貝 (九) 基因轉(zhuǎn)染（gene transfection）技術(shù)（十）RNA干涉(RNA interference）,,核酸雜交/PCR技術(shù)與蛋白表達(dá)【免疫組化/熒光、流式細(xì)胞術(shù)、WB方法結(jié)合、蛋白結(jié)合檢測

36、方法 】---蛋白表達(dá) 在翻譯水平上定位研究基因表達(dá) ---核酸雜交/PCR技術(shù) 檢測DNA/RNA， 在基因或轉(zhuǎn)錄水平研究基因表達(dá),,（十一）DNA-蛋白質(zhì)結(jié)合檢測1.凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)（Gel retardation assay）DNA遷移率變動(dòng)試驗(yàn)（DNA mobility shift assay）或條帶阻滯實(shí)驗(yàn)（Band retardation assay）,,基本 原理： 在非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳 中， D N A

37、和蛋白質(zhì)的復(fù)合物的遷移速度比單一的 D N A片段或雙鏈的寡核苷酸慢 反應(yīng)產(chǎn)物 電泳分析D N A與蛋 白質(zhì)結(jié)合的特異性通過非標(biāo)記D N A競爭性實(shí)驗(yàn)來確定,,2.足跡實(shí)驗(yàn)（foot-printing assay）原理：當(dāng)DNA分子中的某一區(qū)段同特異的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合之后便可以得到保護(hù)而免受DNaseI 酶的切割,而不產(chǎn)生出相應(yīng)的切割分子, 在凝膠電泳放射性自顯影圖片上便出現(xiàn)了一個(gè)空白區(qū),俗稱為“足跡”.,,3.染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)

38、 （chromatin immunoprecipitation assay, CHIP）基本原理：在活細(xì)胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物,并將其隨機(jī)切斷為一定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段,然后通過免疫學(xué)方法沉淀此復(fù)合體,特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段,,（十二） 激光捕獲顯微切割技術(shù)(Laser capture microdissection，LCM) ---顯微鏡直視下---組織切片---確定、分離、純化單一類型細(xì)胞群或