布魯氏菌試管凝集試驗(yàn)

1、布魯氏菌血清學(xué)檢驗(yàn),山西省疾病預(yù)防控制中心張秋香,免疫學(xué)基礎(chǔ),由于布魯氏菌培養(yǎng)的營養(yǎng)條件苛刻而且時(shí)間長，所以布魯氏菌的血清學(xué)診斷越來越受到重視。,主要是根據(jù)相應(yīng)抗原抗體可以在體外發(fā)生特異性結(jié)合并呈現(xiàn)可見反應(yīng)的原理,用已知抗原(或抗體)檢測體液中未知的抗體(或抗原).由于試驗(yàn)時(shí)通常是用患者血清作為待檢材料,所以檢測抗原抗體的體外試驗(yàn)又稱為血清學(xué)試驗(yàn)或血清學(xué)反應(yīng).,血清學(xué)檢查既可協(xié)助早期診斷，還可確定是否復(fù)發(fā)或重復(fù)感染。感染1-2周后，

2、患者血清中出現(xiàn)IgM抗體，可以用凝集試驗(yàn)或抗人球蛋白試驗(yàn)檢測．感染３周后，患者血清中出現(xiàn)IgG抗體，可以用補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)，熒光抗體或ELISA檢測．,虎紅平板的凝集反應(yīng)（RBPT）,原理,該試驗(yàn)又稱為班氏孟加拉紅平板凝集試驗(yàn)。由于所用的抗原是酸性（PH3.6—3.9）帶色的抗原，該抗原與被檢血清作用時(shí)能抑制血清中的IgM類抗體的凝集活性、檢查出的抗體是IgG類，因此提高了該項(xiàng)反應(yīng)的特異性。,器材與試劑,虎紅平板凝集抗原、被檢血清、清潔脫

3、脂玻片或有凹形孔的玻片、0.1ml吸管或微量加樣器、混合棒或牙簽,試驗(yàn)方法,在玻片上加0.03ml被檢血清，然后加入虎紅平板抗原0.03ml，充分混勻，在5分鐘內(nèi)觀察結(jié)果。,(四) 結(jié)果判定,有二種方法，第一種是，出現(xiàn)可見的凝集反應(yīng)就判為陽性；另一種用“+”表示凝集程度按下列標(biāo)準(zhǔn)用加號記錄反應(yīng)強(qiáng)度：++++：出現(xiàn)大的凝聚片或小的粒狀物，液體完全透明，100%凝集+++：有明顯的凝聚片，液體幾乎完全透明，75%凝集++：有可見的凝

4、集片，液體不甚透明，50%凝集+：液體混濁，只有少量粒狀物，25%凝集-：液體均勻混濁,評價(jià),此法簡便、快速、容易操作，適于基層大面積檢疫；此法有一定敏感性，檢查牛的陽性率稍高于綿羊、山羊。因?yàn)樵谒嵝原h(huán)境下IgM活性受抑，該法主要是檢查IgG類凝集抗體，所以特異性較好，與補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、二巰基乙醇（2-ME）試驗(yàn)和抗球蛋白（Coomb’s0）試驗(yàn)有較高的吻合率。該法受制備抗原時(shí)條件影響較大，所以每批制備抗原應(yīng)予以檢查、標(biāo)化方可應(yīng)

5、用。,,,,試管凝集試驗(yàn),試管凝集試驗(yàn)的原理1897年萊特氏等(Wright)與其同事發(fā)現(xiàn)患該病的病人血清與馬爾他細(xì)菌的培養(yǎng)物產(chǎn)生了凝集現(xiàn)象，遂稱之為萊特氏凝集反應(yīng)，成了迄今常用的血清學(xué)診斷方法之一。,,設(shè)備及試劑,試管凝集抗原被檢血清0.5%的石碳酸生理鹽水吸管試管試管架孵箱,操作步驟,被檢血清的稀釋:一般情況下,每份血清用5支小試管,第一管加入2.3毫升石碳酸生理鹽水,第二管不加，第三、四、五管各加入0

6、.5毫升.用1毫升吸管吸取被檢血清0.2毫升,加入第一管中,混勻?；靹蚝? 以該吸管吸取第一管中血清加入第二和第三管各0.5毫升，以該吸管將第三管混勻，并吸取0.5毫升加入第四管,依次稀釋到第五管,混勻后從第五管吸出0.5毫升棄去.如此稀釋后,從第二管起血清稀釋度分別為1:12.5 1:25 1:50 1:100,操作步驟,加入抗原:先以0.5%石碳酸生理鹽水將抗原原液做適當(dāng)稀釋（一般是作1:10稀釋）,稀釋后的抗原加入各稀釋

7、的血清管（第一管不加，作為血清對照）,每管0.5毫升,混勻。加入抗原后，第二管至第五管每管總量為1毫升，從第二管起血清稀釋度分別為1:25 1:50 1:100 1:200，從第一管再吸出0.5毫升，剩1毫升。對照管的制作:抗原對照（適當(dāng)稀釋的抗原加石碳酸鹽水）被檢血清對照陰性對照（陰性血清稀釋后加抗原）陽性對照（陽性血清稀釋到原有滴度加抗原）,,然后將試驗(yàn)管和對照管充分混勻后，放于37℃溫箱中20-22小時(shí)后取出，在室溫下放

8、置2個小時(shí)，以比濁管為標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。,結(jié)果的判定,判定比濁管的制備:每次試驗(yàn)須配制比濁管作為判定的標(biāo)準(zhǔn)依據(jù).配制方法是:取本次試驗(yàn)用的抗原稀釋液（一般1:10）5-10毫升，加入等量的0.5%石碳酸生理鹽水作倍比稀釋，按下表配制比濁管比濁管的配制,試管凝集反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)比濁管配制,管號 抗原稀釋液（ml） 生理鹽水（ml） 透明度 標(biāo)記1 0.00

9、 1.00 100% ++++ 2 0.25 0.75 75% +++ 3 0.50 0.50

10、 50% ++ 4 0.75 0.25 25% ＋5 1.00 0.00 0% －,結(jié)果記錄,根

11、據(jù)各管中上層液體的清亮程度記錄結(jié)果，特別是50%清亮度（++）對判定結(jié)果關(guān)系較大，一定要與比濁管對比判定血清對照為清亮透明無沉淀,抗原對照為均勻混濁在兩種對照管都成立的情況下，才可判定試驗(yàn)管，否則應(yīng)重做。對沉淀需要經(jīng)驗(yàn)判定。,,“+++” 幾乎完全凝集，上清液75%清亮“++”顯著凝集，上清液50%清亮“+” 微量凝集，液體25%清亮 “-” 無凝集，液體不清亮確定每份血清滴度是以出現(xiàn)“++”及以上的凝集現(xiàn)象的最高血清稀釋度,

12、“++++”完全凝集，上清液100%清亮,診斷標(biāo)準(zhǔn),沒有進(jìn)行過菌苗接種的人、畜血清試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)是：人、牛、馬、鹿、駱駝等大家畜血清為1：100( ++)及以上者為陽性，1：50(++)為可疑。豬、羊(綿羊、山羊)、犬等小家畜血清在1：50(++)及以上者為陽性，1：25(++)為可疑。對可疑反應(yīng)的人和動物應(yīng)在10-25天內(nèi)重復(fù)檢查，以便進(jìn)一步確定診斷。,影響試驗(yàn)結(jié)果的因素及注意事項(xiàng),受檢血清應(yīng)新鮮、無溶血、無污染，存放血清處溫度不能

13、超過10℃，采血后應(yīng)于3—4日內(nèi)進(jìn)行檢查，因放置時(shí)間過長可能會導(dǎo)致血清效價(jià)降低。 遵守操作規(guī)程：所用的器材要清潔、干燥，試劑的加量一定要正確，放入溫箱的溫度和時(shí)間都要按要求，否則都影響結(jié)果。每份血清和抗原均要有對照。高滲鹽水作凝集反應(yīng)，一般濃度在10~12%，一般切記人血清不能用高滲鹽水。,,作凝集反應(yīng)時(shí)，有個別血清會出現(xiàn)前帶現(xiàn)象，即稀釋度低的血清管內(nèi)(或血清量多的格)不發(fā)生凝集，而稀釋度高的管內(nèi)(或血清量少的格)出現(xiàn)凝集，這叫做前

14、帶現(xiàn)象。如果某血清在平板凝集反應(yīng)中出現(xiàn)了前帶現(xiàn)象，那么做試管反應(yīng)時(shí)應(yīng)多做幾個管，多采用幾個稀釋度。 氯化鈉的含量增高對血清反應(yīng)有明顯的影響，鹽的濃度越高，反應(yīng)的敏感性提高，因此在獸醫(yī)界為了克服凝集反應(yīng)中的阻抑抗體的干擾，對羊血清采用高滲鹽水作凝集反應(yīng)，一般濃度在10~12%，切記一般人血清不能用高滲鹽水。,,前帶現(xiàn)象產(chǎn)生的原因① 膠體粒子學(xué)說：血清稀釋度低所含的膠體粒子多，它影響抗原抗體的結(jié)合，而稀釋度高的則含膠體粒子少，所以出現(xiàn)凝

15、集。② 不完全抗體學(xué)說：血清中因存在不完全抗體競爭抗原，所以在低稀釋度的管中不凝集。③ 抗原抗體比例失調(diào)，也就是抗體過?；蜓鍍?nèi)含有過多防腐劑，嚴(yán)重污染可造成前帶現(xiàn)象的產(chǎn)生，封閉抗原的干擾。,評價(jià),該方法特異性較好，敏感性也高，因此適用于檢疫和臨床診斷。由于該試驗(yàn)有時(shí)出現(xiàn)前帶現(xiàn)象和封閉現(xiàn)象，所以有時(shí)也出現(xiàn)假陰性結(jié)果，必要時(shí)和其它方法聯(lián)合應(yīng)用。,抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn),抗原抗體結(jié)合的特異性,抗原抗體結(jié)合的基礎(chǔ)是抗原決定簇與抗體的抗原結(jié)合

16、部位之間 的反應(yīng).這種反應(yīng)是專一性的.例如:布氏桿菌只能與布氏桿菌抗體相結(jié)合,而不能與痢疾桿菌抗體相結(jié)合.,抗原抗體 結(jié)合的表面性,抗原抗體的結(jié)合僅僅是分子表面的結(jié)合，雖然兩者的結(jié)合相當(dāng)穩(wěn)定，但結(jié)合后的抗原抗體，其本身的結(jié)構(gòu)，生物學(xué)活性均未遭到破壞,并且在一定條件下可解離.即抗原抗體的結(jié)合是可逆的,所以,解離抗原抗體復(fù)合物的方法可用于 提取,純化抗原或抗體.,抗原抗體結(jié)合的適當(dāng)比例,抗原是多價(jià)的(分子表面有多個抗原決定簇)，抗體一般是雙

17、價(jià)的，(分子的末端有兩個抗原結(jié)合部位)，所以，二者的結(jié)合就有一個比例關(guān)系問題．只有抗原抗體比例適當(dāng)，才能形成較大的，容易觀察的復(fù)合物．如若比例不當(dāng),就不能形成較大復(fù)合物.所以試驗(yàn)時(shí)要根據(jù)不同情況對抗原抗體(甚至兩者同時(shí))進(jìn)行連續(xù)稀釋,以便更好地提供兩者最適的比例.顆粒性抗原,因其分子較大,形成可見的凝集物質(zhì)所需的抗體較少,所以試驗(yàn)時(shí)一般把含有抗體的血清做連續(xù)稀釋,盡管如此,有時(shí)還能在含有較多抗體的前列試管中,因兩者比例不當(dāng)不呈現(xiàn)可見反應(yīng)

18、,這種現(xiàn)象被稱為前帶現(xiàn)象.,抗原抗體結(jié)合的階段性抗原抗體的結(jié)合分為兩個階段第一階段:特異性結(jié)合階段,反應(yīng)快,只需幾秒或幾分即可完成.但不出現(xiàn)肉眼可見的反應(yīng).第二階段:抗原抗體結(jié)合的可見階段,這一階段的反應(yīng)是可見的,反應(yīng)較慢,常需幾分鐘，幾十分鐘或更久。,,抗原抗體反應(yīng)的影響因素,電解質(zhì)；抗原抗體反應(yīng)必須有適量的電解質(zhì)參加，否則不出現(xiàn)可見反應(yīng)，一般拿0.85化鈉溶液做為抗原或抗體的稀釋液。溫度：適當(dāng)提高溫度可以增多抗原與抗體的碰撞

19、機(jī)會。促進(jìn)反應(yīng)現(xiàn)象加速出現(xiàn)。一般最適溫度范圍在0-56之間。在這個范圍內(nèi)，溫度低，對反應(yīng)的促進(jìn)作用較小，但生成的復(fù)合物不易解離。溫度高，對反應(yīng)的促進(jìn)作用較大，但生成的復(fù)合物容易解離。實(shí)際工作中，多數(shù)反應(yīng)在37進(jìn)行。在試驗(yàn)過程中，一般在加溫之前，適度的振搖抗原抗體的混合液，也能增加兩者之間的碰撞機(jī)會。酸堿度：一般以6.0-8.0為宜，若低至3左右，因接近細(xì)菌的等電點(diǎn)，可引起細(xì)菌性抗原非特異性的酸凝集，影響試驗(yàn)結(jié)果。,血清學(xué)試驗(yàn)的對照,由