豬瘟病毒SPA協(xié)同凝集試驗(yàn)及雙夾心ELISA檢測(cè)方法的建立.pdf

1、本研究通過PK-15細(xì)胞增殖豬瘟石門系強(qiáng)毒F114株(CSFV-F114)，通過制備犢牛睪丸細(xì)胞增殖豬瘟中國兔化弱毒C株(HCLV)。HCLV株病毒液經(jīng)反復(fù)凍融后利用聚乙二醇6000濃縮并純化，得到純度較高的HCLV。將濃縮純化的病毒液分別免疫家兔和豬，制備了兔抗HCLV及豬抗HCLV的高免血清，經(jīng)飽和硫酸銨沉淀、透析除鹽后，獲得了兔抗HCLV及豬抗HCLV免疫球蛋白IgG的粗提物。 依據(jù)金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁上的A蛋白(SPA)

2、的特性，用富含A蛋白的金黃色葡萄球菌國際標(biāo)準(zhǔn)株(CowanI)標(biāo)記兔抗HCLV及豬抗HCLV高免血清，建立了診斷豬瘟的SPA平板協(xié)同凝集試驗(yàn)。用不同稀釋度的抗血清制備SPA診斷液進(jìn)行協(xié)同凝集試驗(yàn)，兔抗HCLV原倍血清，豬抗HCLV陽性血清2倍稀釋所得診斷液效果最理想。對(duì)兩種血清標(biāo)記的SPA診斷液的靈敏度進(jìn)行對(duì)比，兔抗HCLVSPA診斷液抗原的最高檢出濃度為：1:32，豬抗HCLVSPA診斷液抗原的最高檢出濃度為：1:64。與對(duì)流免疫電泳

3、檢測(cè)到1:2倍稀釋的抗原相比，該方法敏感性較高。通過對(duì)發(fā)病動(dòng)物各臟器靈敏度的檢測(cè)，證明在臨床運(yùn)用SPA協(xié)同凝集法檢測(cè)豬瘟的診斷中淋巴結(jié)和脾臟為最佳檢測(cè)部位。此外，該操作簡(jiǎn)便、快速，節(jié)省材料，無需特殊儀器，是一種適用于基層豬場(chǎng)對(duì)豬瘟的快速診斷和流行病學(xué)調(diào)查的新技術(shù)。 利用兔抗HCLVIgG，豬抗HCLVIgG及羊抗兔酶標(biāo)抗體，建立了雙夾心ELISA用于檢測(cè)CSFV抗原的免疫學(xué)方法。試驗(yàn)確定的兔抗HCLVIgG，豬抗HCLVIgG及

4、酶標(biāo)抗體的最佳使用濃度分別為1:40，1:200，1:400。經(jīng)敏感性試驗(yàn)、特異性阻斷及交叉試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)，結(jié)果表明該檢測(cè)方法具有敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。是一種適用于實(shí)驗(yàn)室確診豬瘟病毒的方法。 應(yīng)用本研究建立的兩種檢測(cè)CSFV抗原的方法對(duì)50例臨床樣本進(jìn)行了檢測(cè)。SPA協(xié)同凝集試驗(yàn)檢出陽性樣本6份，陽性檢出率12﹪，4～7min內(nèi)即可觀察到結(jié)果；雙夾心ELISA檢出陽性樣本10份，陽性檢出率20﹪，所需時(shí)間約24h