兔出血癥病毒樣顆粒疫苗的研制和雙抗夾心ELISA方法的建立.pdf

1、兔出血癥病毒（RHDV）的感染主要引起成年兔發(fā)生病毒性出血癥（RHD）,其致死率約70-100％。RHDV感染呈世界性分布，是影響和危害養(yǎng)兔業(yè)發(fā)展的最主要病原。疫苗接種在治療和預(yù)防RHD疾病傳播中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。盡管近年來(lái)亞單位疫苗的研制取得了快速的發(fā)展，但由于抗原制備成本高以及表達(dá)量低等特點(diǎn)，目前商業(yè)疫苗仍然主要是組織滅活疫苗。本研究根據(jù) RHDV結(jié)構(gòu)蛋白 VP60具有自我組裝形成病毒樣顆粒（VLPs）的特點(diǎn),利用含SUMO蛋白

2、標(biāo)簽的原核表達(dá)技術(shù)，首次利用大腸桿菌表達(dá)的重組 VP60蛋白在體外制備了VLPs，進(jìn)一步制備RHDV VLPs疫苗。同時(shí)，利用VLPs作為免疫原接種小鼠，獲得7株抗VP60蛋白單克隆抗體（Mab），進(jìn)而利用單克隆抗體建立了一種快速、操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)的用于檢測(cè)RHDV的雙抗夾心（DAS）ELISA方法。
　　首先，將RHDV VP60基因克隆并插入原核表達(dá)載體 pSMK中，獲得重組質(zhì)粒pSMK-VP60，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到 BL21

3、-condon Plus（DE3）-RIL表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)SDS-PAGE分析，重組蛋白在大腸桿菌中部分以可溶性表達(dá)，大小約為85kDa。利用鎳柱親和層析方法獲得高純度的重組蛋白 His-SUMO-VP60蛋白。Western blot方法顯示該重組蛋白可以被兔抗VP60多克隆抗血清識(shí)別。重組VP60蛋白的表達(dá)為下一步研究體外制備VLPs提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　利用特異性SUMO蛋白酶對(duì)重組蛋白進(jìn)行酶切和純化，通過(guò)電子投射顯微

4、鏡觀察VP60蛋白能夠自我組裝形成直徑約為25~30nm大小的VLPs，其形態(tài)結(jié)構(gòu)類似于親本RHDV粒子。Western blot方法結(jié)果顯示該VLPs可以被兔抗VP60多克隆抗血清識(shí)別，表明體外制備VLPs具有和VP60蛋白相似的抗原性；
　　分別將組織滅活疫苗、His-SUMO-VP60、VLPs和PBS免疫實(shí)驗(yàn)兔。以間接ELISA方法檢測(cè)結(jié)果顯示VLPs免疫兔后抗體消長(zhǎng)規(guī)律同滅活疫苗相類似，抗體呈上升趨勢(shì)。同時(shí)淋巴細(xì)胞增殖以

5、及細(xì)胞因子 IL-4和 IFN-γ的水平都明顯高于 PBS對(duì)照組。以上結(jié)果表明RHDV VLPs具有刺激兔體液免疫和細(xì)胞免疫的能力，具有作為RHD疫苗的潛力。
　　由于RHDV VLPs展現(xiàn)出良好的免疫原性，我們利用VLPs作為免疫原制備了抗VP60單克隆抗體。首先，將VLPs免疫小鼠，加強(qiáng)免疫后將小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞進(jìn)行了融合。以兔RHDV陽(yáng)性肝臟研磨液作為檢測(cè)抗原，利用間接ELISA方法篩選獲得7株能穩(wěn)定分泌抗VP60單

6、克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，分別命名為4A1，5B2，6F6，9H9，11D4，15C3，16F2。Western blot結(jié)果表明7株抗VP60 Mabs都可與His-SUMO-VP60蛋白反應(yīng)；IFA結(jié)果表明7株Mabs都可以與真核重組表達(dá)質(zhì)粒pSCA1/VP60在BHK-21細(xì)胞中表達(dá)的重組蛋白反應(yīng)。通過(guò)抗體配對(duì)實(shí)驗(yàn)，確定以9H9為捕獲抗體，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記(HRP)的9H9為檢測(cè)抗體建立雙抗夾心ELISA方法。利用單克隆抗體作為捕獲