煙草花葉病毒的修飾和調(diào)控及其與安托芬類似物的相互作用研究.pdf

1、煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)作為一種模式病毒,人們對(duì)它的研究已經(jīng)有一百五十年的歷史了,它是一種對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)有極大危害的植物病毒病原體,同時(shí)也是植物病毒中研究的最為詳細(xì)的一種,在形態(tài)、粒體結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成、組裝、外殼、亞基組成、基因組結(jié)構(gòu)、核酸復(fù)制、蛋白翻譯、病毒在細(xì)胞間的運(yùn)動(dòng)等方面常作為病毒學(xué)研究的經(jīng)典范例,幾乎所有關(guān)于病毒的研究都是從煙草花葉病毒起步的。由于煙草花葉病毒獨(dú)特的組裝性質(zhì)及其處于納米尺度的天

2、然優(yōu)勢(shì),近年來它已經(jīng)成為了一種良好的植物病毒載體,并且在納米科學(xué)領(lǐng)域也有日益廣泛的應(yīng)用,可以說,對(duì)煙草花葉病毒的研究不僅具有重大的理論價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義,同時(shí)具有十分廣闊的應(yīng)用前景。
　　 本文從兩大方面關(guān)注煙草花葉病毒:第一方面是抗煙草花葉病毒的研究,主要集中于安托芬(Antofine)與煙草花葉病毒之間的相互作用。以Antofine為生物活性探針,研究它發(fā)揮生物功能的靶標(biāo)和作用模式,在前人工作的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步揭示Antofine

3、抑制煙草花葉病毒的機(jī)制,探索抗病毒藥物開發(fā)的新途徑和新思路；另一方面,以煙草花葉病毒為靶標(biāo),對(duì)其進(jìn)行顆粒修飾和粒度調(diào)控,在加深對(duì)煙草花葉病毒自身性質(zhì)認(rèn)識(shí)的同時(shí),實(shí)現(xiàn)人為調(diào)控病毒的表面特征和顆粒大小,為進(jìn)一步利用它作為基因藥物載體和制備可調(diào)控生物納米材料奠定基礎(chǔ)。
　　 本文的工作分為以下四個(gè)部分:
　　 一、煙草花葉病毒與Antofine及其類似物的相互作用研究。Antofine是一種具有顯著抗煙草花葉病毒活性的天然產(chǎn)物

4、,這種天然產(chǎn)物具有潛在的細(xì)胞毒性和抗癌活性,因此,一直以來都受到科學(xué)家們的關(guān)注。Antofine是個(gè)具有近似平面結(jié)構(gòu)的分子,本課題組過去的研究發(fā)現(xiàn)Antofine與帶有凸起結(jié)構(gòu)的DNA具有特異性相互作用。本文利用熒光光譜、紫外可見光譜等方法,進(jìn)一步確定了Antofine與帶有凸起結(jié)構(gòu)DNA之間的作用模式,并設(shè)計(jì)合成了一系列具有更細(xì)微結(jié)構(gòu)和序列特征的DNA,測定了它們與Antofine相互作用的解離常數(shù),獲得了更完整的結(jié)論。
　　

5、 Antofine具有良好的抗煙草花葉病毒性質(zhì),但是關(guān)于它作用靶標(biāo)的研究卻十分有限。本課題組張偌瑜博士已經(jīng)證實(shí)Antofine與TMV RNA之間存在強(qiáng)的相互作用(表觀解離常數(shù)在nM級(jí)別)。本文在此工作基礎(chǔ)上測定了Antofine與TMV殼蛋白之間的解離常數(shù),通過熒光滴定的方法測定了一系列Antofine的類似物與TMV RNA之間的相互作用常數(shù)以及通過核酸酶抗性實(shí)驗(yàn)測定了它們抑制煙草花葉病毒組裝的百分比。我們發(fā)現(xiàn),Antofine與T

6、MV殼蛋白的解離常數(shù)較之與TMV RNA的解離常數(shù)高了四個(gè)數(shù)量級(jí),說明在抑制TMV組裝的過程中,Antofine與TMV RNA之間的結(jié)合具有絕對(duì)的競爭力。Antofine類似物和核酸之間的結(jié)合能力與它們抑制病毒組裝的能力呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系,從而進(jìn)一步確認(rèn)TMV RNA是Antofine抑制病毒的靶標(biāo),Antofine及其類似物通過與TMV RNA相互作用抑制病毒組裝,實(shí)現(xiàn)抗病毒活性。
　　 二、體外篩選TMV起始組裝序列文庫的結(jié)果

7、分析。煙草花葉病毒起始組裝位點(diǎn)在病毒組裝過程中具有重要的作用,Antofine對(duì)TMV組裝的抑制很大程度上都來源于對(duì)起始組裝位點(diǎn)的識(shí)別。為了更深入的了解起始組裝位點(diǎn)的組裝特性,本課題組利用SELEX技術(shù),對(duì)含有～109種不同序列的起始組裝位點(diǎn)文庫進(jìn)行了篩選。本文將篩選得到的全部序列進(jìn)行了測序,并對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行了分析和歸納,總結(jié)了其中的規(guī)律。我們發(fā)現(xiàn):頂端loop結(jié)構(gòu)“NNG”的特征并不明顯,但N具有嘌呤堿基偏好且對(duì)于C堿基的排斥很明顯；

8、apex最頂端的G堿基對(duì)于組裝有重要的作用；靠近莖環(huán)頂部stem區(qū)域堿基對(duì)的熔鏈能力對(duì)于組裝至關(guān)重要；G-U wobble堿基配對(duì)對(duì)于OriRNA和殼蛋白的識(shí)別可能具有重要作用。從序列出現(xiàn)的豐度來看,野生型序列出現(xiàn)的次數(shù)最多,說明人工進(jìn)化和自然選擇得到了相同的結(jié)果。
　　 三、煙草花葉病毒的顆粒修飾與粒度調(diào)控。近年的研究趨勢(shì)表明,越來越多的關(guān)注集中于煙草花葉病毒本身極其規(guī)律的螺旋堆積方式。很多科學(xué)家利用煙草花葉病毒作為氧化物、金

9、屬附著的模板,通過修飾病毒內(nèi)外表面殼蛋白上特殊的氨基酸,使病毒帶有諸如導(dǎo)電性,聚合性等特征。因此,煙草花葉病毒在納米科學(xué)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景,另外,由于病毒可以利用宿主細(xì)胞表達(dá)外源蛋白,使它成為了良好的植物病毒載體。TMV在其他科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用日益廣泛,要想更好的拓展TMV的應(yīng)用,最基本的還是要增強(qiáng)對(duì)其本身特性的了解。無論在納米科技領(lǐng)域還是生物醫(yī)藥領(lǐng)域,對(duì)TMV的應(yīng)用都離不開對(duì)其表面性質(zhì)以及組裝與解組裝過程的認(rèn)識(shí)。本文采用光化學(xué)交聯(lián)法對(duì)

10、病毒顆粒表面的酪氨酸進(jìn)行了交聯(lián),測定了交聯(lián)對(duì)于病毒顆粒穩(wěn)定性、完整性和侵染性的影響。利用锍鹽烷基化結(jié)合“Click”反應(yīng)的方法對(duì)煙草花葉病毒進(jìn)行了熒光標(biāo)記,開辟了一種新的生物連接途徑,對(duì)實(shí)時(shí)監(jiān)測煙草花葉病毒在細(xì)胞內(nèi)的定位提供了有效的手段。
　　 煙草花葉病毒具有簡單而規(guī)律的組裝特性,它的組裝只需要起始組裝位點(diǎn)與殼蛋白的識(shí)別,對(duì)延伸的RNA鏈并沒有序列和長度的限制,這一特性使它成為了植物病毒載體,同時(shí),也使其具備了構(gòu)建生物納米材料

11、的可能。但是,天然病毒的尺度固定在300nm,極大的限制了它的可利用范圍,我們希望能夠人為的控制它的長度。本文采取兩種方法進(jìn)行病毒顆粒的調(diào)控:(1)嘗試?yán)闷鹗冀M裝位點(diǎn)來引導(dǎo)DNA的組裝。DNA分子在自然界分布廣泛,相比于RNA分子,DNA分子更穩(wěn)定,也更容易得到任意長度的核酸鏈。我們利用T4 RNA連接酶將RNA片段和DNA片段連接在一起,構(gòu)建了153個(gè)核苷酸的雜合鏈,并檢測了它們被TMV殼蛋白包裹的能力。(2)通過控制體外重組的RN

12、A的長度來實(shí)現(xiàn)精確控制病毒顆粒的粒度。我們通過PCR得到不同長度的DNA分子,利用體外轉(zhuǎn)錄的方法得到其對(duì)應(yīng)的RNA片段,這些片段都含有起始組裝位點(diǎn)序列,進(jìn)一步與殼蛋白進(jìn)行體外組裝,形成具有均一長度的納米顆粒,實(shí)現(xiàn)對(duì)顆粒粒度的精確調(diào)控。
　　 四、煙草花葉病毒殼蛋白的體外表達(dá)。TMV的表面修飾手段多種多樣,但是無論通過酶法還是化學(xué)法都很難實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)修飾。我們考慮在大腸桿菌中對(duì)煙草花葉病毒的殼蛋白進(jìn)行體外表達(dá)。利用表達(dá)出來的殼蛋白進(jìn)行

13、組裝,能夠?qū)崿F(xiàn)多方面,多位點(diǎn)的修飾,這對(duì)于TMV組裝機(jī)制的研究有極大的促進(jìn)作用。我們成功的在大腸桿菌中表達(dá)了TMV殼蛋白,并檢測了它組裝核酸的能力。
　　 研究Antofine與煙草花葉病毒的作用模式,對(duì)病毒進(jìn)行表面修飾和粒度的精確控制以及實(shí)現(xiàn)殼蛋白的體外表達(dá),開拓了開發(fā)抗病毒藥物的思路,加深了對(duì)其特性的認(rèn)識(shí),豐富了調(diào)控它的手段?？偠灾?病毒防治是醫(yī)藥和農(nóng)藥研發(fā)領(lǐng)域中極其重要的課題,對(duì)Antofine抑制TMV組裝靶點(diǎn)的尋找、